CRMP-1调控神经元骨架蛋白重构在癫痫发作中的机制研究

A current accepted concept is that most epileptic seizures due to genetics background, study of epigenetic mechanisms in epilepsy has found that DNA methylation may plays an important part in epileptogenesis. By DNA methylation screening in the brain of refractory epilepsy and theoretical bioinformatics analysis of differentially expressed genes, we have found that the mythylation level of collapse response regulatory proteins(CRMP-1) in regulating axon guidance is higher in epileptic brain than control brain, and the same result was found in animal model. Under the support of National Natural Science Foundation of China, we have finished the project of: The role of miRNAs in regulating genes silecne and synaptic activation in the formation of drug-resistant epilepys. We have found a brain tissue bank which contains more than 300 cases of brain tissues from patients who received surgery for intractable epilepsy and we also successfully established many kinds of epilepsy animal models. Using the in vivo multi-channel recording methods for EEG with methods of transfection, fluorescent staining of the actin cytoskeleton and electrophysiology (patch-clamp), to evaluated weather the CRMP-1 can modifying the epileptic seizure and epileptiform discharge of rat models through gene knock-down and over-expression.This study will investigate the role of CRMP-1 in epileptogenesis and explore their effects on downstream signaling, aimed to establish a regulating gene-target-disease chain, and uncover their potential mechanisms in epileptogenesis.

大多数癫痫发作都具有遗传元素背景，对癫痫进行的表观遗传学研究发现DNA甲基化参与了癫痫的发生发展，并逐渐成为癫痫研究的新领域。通过全基因组DNA甲基化芯片扫描，课题组发现参与调节轴突导向的坍塌反应调节蛋白（CRMP-1）在癫痫患者脑组织中甲基化程度增高，点燃动物模型中也发现类似结果。本项目拟在国家自然科学基金委前期资助项目《调控沉默基因及突触激活的miRNA在耐药性癫痫形成中的作用》研究基础上，继续利用课题组建立的由300多例耐药性癫痫患者手术后脑组织组成的脑库和4种癫痫动物模型，通过对点燃癫痫动物模型脑内CRMP-1基因进行敲除、过表达干预，结合在体多通道脑电监测，同时采用转染、细胞骨架蛋白染色、全细胞膜片钳等技术从基因表达、功能、机制三个层面进一步探索CRMP-1在癫痫发作中的作用及其信号通路，建立基因-靶点-疾病链，以揭示其调控癫痫发生的可能机制，为癫痫的防治提供新思维和路径。

1.项目背景：.本课题是在课题组前期癫痫DNA甲基化研究工作的基础上，对CRMP-1蛋白参与耐药癫痫神经元异常迁移机制进行研究。 .2. 主要研究内容：.用癫痫动物模型、细胞模型及难治性癫痫患者术后脑组织，研究CRMP-1蛋白对癫痫活动的影响。 .3. 主要研究工作：. 1）研究中建立了戊四氮、匹罗卡品动物模型，采用CRMP-1过表达及shRNA慢病毒对CRMP-1基因进行沉默、过表达等方法分别在动物模型中进行了靶基因对癫痫动物行为学和电生理影响的研究。. 2）在原代海马神经元中通过慢病毒抑制和过表达研究了CRMP-1蛋白在癫痫皮质异常迁移假说中作用机制及其对细胞骨架蛋白影响。. 3）利用在前期研究中建立的由300多例耐药性癫痫患者手术后脑组织组成的脑库，通过蛋白印迹、免疫组化、免疫荧光双标研究了CRMP-1蛋白及上、下游基因在癫痫患者及动物模型脑组织中表达的一致性。. 4）通过小鼠子宫内胚胎电转的方法对CRMP-1基因在小鼠大脑皮层发育过程中的作用进行研究，了解其参与癫痫鼠异常皮质发育的调控机制。. 4. 重要结果和关键数据：. 1）发现耐药性癫痫患者脑组织中CRMP-1蛋白主要在神经元中表达，过表达或抑制其功能对癫痫动物的行为学及电生理活动有明显影响；. 2）胚胎电转研究表明敲低CRMP-1表达可以阻碍神经元迁移, 这一研究发现提示CRMP-1可能通过调节皮层神经元的迁移参与耐药癫痫发作机制，为耐药癫痫的防治提出了一条新的途径。. 5. 取得的阶段性成果：研究中先后发表科研论文2篇被SCI收录，完善了癫痫皮质异常迁移及其可能的调节机制的研究。培养博士1名。..