JNK信号通路调控ENT1在大鼠癫痫样放电及癫痫发作中的作用及机制研究

The formation mechanism of Epileptiform discharge and epilepsy is not very clear, the current study considered it’s closely related to the changes of neurotransmitter balance. Adenosine is an inhibitory neurotransmitter of central nervous system, which is closely related with epilepsy. Equilibrative nucleoside transporter -1（ENT1）can regulate the nerve cells adenosine levels inside and outside because of the changes in the microenvironment. By adjusting the nerve cells inside and outside adenosine levels contribute to seizure termination. Recent studies have confirmed that after the seizure, and the c-Jun N-terminal kinase (JNK) signaling pathway is significantly activated in neurons. The activation of the JNK signaling pathway, has some effects on the regulation of ENT1 expression and its function. But the current JNK signal transduction pathway to regulation of ENT1 thus affecting the epileptiform discharges and the formation of epilepsy has not been reported. This project aims to establish rat epileptic model. To observe the changes of behavior and EEG, and detect the electrophysiological changes by patch clamp in brain slices. In addition, ENT1and p-JNK will be detected by molecular biology experiment, before and after the use of JNK inhibitor. We aim to reveal the molecular signals mechanism of epilepsy formation, and provide laboratory basis for prevention and treatment of epilepsy.

癫痫样放电及癫痫形成机制不很清楚，目前研究考虑与神经递质平衡改变密切相关。腺苷作为一种中枢神经系统的抑制性神经递质，与癫痫关系密切。平衡型核苷转运体-1（ENT1）可因微环境的变化而调节神经细胞内外腺苷的水平。通过调节神经细胞内外腺苷的水平有助于终止癫痫发作。近来研究证实癫痫发作后，神经元内c-Jun氨基端激酶（JNK）信号通路被明显激活。而JNK信号转导通路的激活，对ENT1的量的表达及其功能都具有一定的调控作用。但目前JNK信号转导通路如何调控ENT1从而影响癫痫样放电及癫痫形成尚无文献报道。本项目拟建立癫痫大鼠模型并对其进行研究，观察动物行为及脑电的变化，以及膜片钳监测脑片电生理的变化，分子生物学技术检测神经元ENT1及p-JNK的表达，观察JNK 特异性抑制剂使用前后ENT1 变化情况，从分子信号机制的角度揭示癫痫形成机制，为癫痫的防治提供可能的实验室依据。

研究背景：本研究拟在我科前期实验的基础上，通过选择JNK信号通路为切入点，使用JNK的特异抑制剂SP600125，探讨JNK信号通路调控ENT1在癫痫样放电及癫痫发作的作用及其机制。.主要研究内容：1.建立SD 大鼠的氯化锂-皮罗卡品药物模型，分组并进行干预，视频脑电图观察不同分组大鼠的行为学及脑电图，免疫组化及免疫荧光观察JNK特异性抑制剂SP600125对p-JNK和ENT1的影响情况，Western blot观察SP600125对p-JNK和ENT1的影响情况。2.以在体研究为基础，选择癫痫发作后ENT1 异常表达最为明显的时间点的造模大鼠入组作为模型组，全细胞膜片钳对比观察记录并比较正常大鼠及模型大鼠脑片的神经元癫痫样放电动作电位的频率，诱发的兴奋性突触后电流的幅值，以及刺激诱发的单突触电流的幅值；运用全细胞膜片钳技术，对比观察记录SP600125对离体脑片的神经元癫痫样放电、eEPSC 、NMDA 及AMPA 电流幅值的影响情况。.结果：1.行为学上，大鼠癫痫发作潜伏期在使用SP600125抑制剂后明显延长；2.免疫荧光检测 p-JNK在海马区表达情况：p-JNK 绿色荧光在 CA1 区、 CA3 区锥体细胞层和齿状回颗粒细胞均有表达，2h达高峰；3.膜片钳实验中，可发现海马CA1区锥体神经元结构清晰且呈线型；经红外处理后，在显示器上可见海马CA1区的锥体细胞外形饱满，且各细胞的突起清晰可见；在全细胞膜片钳技术的电流钳模式下，发现在不同组别的所记录神经元膜电位及每秒动作电位次数已趋于稳定，其中膜电位绝对值的比较，对照组较模型组降低；每秒动作电位次数相比，模型组较对照组明显增多；在其灌流15 min左右时发现动作电位的频率明显下降，ACSF洗脱后，动作电位频率又逐渐恢复；在其灌流15 min左右时发现eEPSC的幅值明显下降。.结论：通过 SP600125（JNK 的强效抑制剂）阻断 JNK 信号通路，可以影响 ENT1 的表达及功能，从而干扰离体脑片的癫痫样放电以及癫痫大鼠的癫痫发作，针对JNK信号通路状态进行干预可以纠正神经细胞异常放电，从而能够抵抗癫痫环境刺激下的癫痫形成。.成果：本项目已发表 SCI 两篇，中文期刊 2 篇。.意义：通过调控JNK的功能，可能有助于为形成新的抗癫痫临床药物开发提供实验室依据，改变目前临床上癫痫治疗瓶颈。