青蒿CYP71AV1基因人工进化及青蒿素全合成酵母工程菌构建

天然青蒿中青蒿素含量极低，难以满足抗疟药市场需求。为此，全球竞相开展了在微生物体内重建青蒿素合成途径的研究。目前仅育成青蒿酸生产菌，而青蒿素全合成却至今未能实现，其原因可能是分离的青蒿CYP71AV1并非催化青蒿素合成的CYP或在微生物中催化性能发生改变。为此，我们拟在前期育成紫穗槐二烯酵母工程菌的基础上，采用以下策略构建青蒿素全合成酵母工程菌：（1）CYP71AV1基因改造及导入：利用DNA "洗牌"（shuffling）技术将CYP71AV1基因由青蒿酸催化型改造成双氢青蒿酸催化型；（2）反义鲨烯合酶基因导入：部分阻遏酵母麦角固醇合成，引导碳源流向青蒿素途径；（3）CPR基因导入：为青蒿素前体还原反应提供丰富的NADPH；（4）启用单线态氧生成系统：促进双氢青蒿酸转变为青蒿素；（5）利用疟原虫微室培养PfLDH高通量检测平台筛选高产青蒿素，为最终以青蒿素全合成微生物取代青蒿铺平道路。