基于溢流代谢调控的富马酸合成路径改造研究

Microbial cell factories (MCF) are capable of transforming renewable biomass resources into raw materials for energy, chemical, pharmacy, food and agriculture. However, when MCF are constructed, the multi-gene pathways are introduced. This process usually gives rise to metabolic imbalance and intermediate metabolite accumulation, thus rsulting in serious overflow metabolism and low substrate transmission efficiency. In this project, these bottlenecks for fumarate production are progressively solved to enhance the efficiency of producing fumarate by designing the optimal fumarate biosynthetic pathway, constructing the precursor pool for fumarate production, optimizing intermediate metabolites transmission efficiency in the reductive pathway, blocking branch pathways for fumarate metabolism. The research strategies and idea used in this project are not only useful for the construction of the metabolic pathway for the other chemicals, but also are academic value for the studies of the unknown pathway enzymes in metabolic engineering.

微生物细胞工厂能够将可再生生物质资源大规模转化为人类所需的能源、化工、医药、食品及农业原材料。然而，由于大部分微生物细胞工厂的构建，需要引入部分或完整异源代谢途径，因此，容易引起溢流代谢。本项目通过设计富马酸合成途径、构建富马酸合成前体库、优化富马酸还原路径底物传输效率、阻断富马酸的分解代谢路径，逐步降低富马酸合成过程中的溢流代谢，提高富马酸的合成效率。所采用的研究思路和设计方法对其他化学品高效合成路径的构建与解析具有一定的参考价值，同时对代谢工程中未知限速途径酶的调控研究也具有一定的借鉴意义。

富马酸是TCA循环中自然存在的重要有机酸，被广泛应用于食品、医药和化工等领域。然而，微生物法生产富马酸的本源合成路径效率较低。本项目针对代谢工程改造微生物合成富马酸关键环节：在富马酸合成上游模块重构方面，重构了富马酸合成上游前体库—丙酮酸，并通过改造AMP代谢提高了菌株的耐酸性，改善了丙酮酸积累效率；在富马酸合成中游模块强化方面，基于化学计量学设计了富马酸合成中游前体—苹果酸的合成途径，并通过协同ATP依赖型的1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RuBisCO)支路和ATP再生型的PCK还原支路、阻断苹果酸降解和碳流竞争途径、引入异源苹果酸合成途径关键酶AsPCK和AsMDH，最终实现了CO2固定型苹果酸合成途径的重构，提高了苹果酸的积累量；在富马酸合成下游模块优化方面，借助DNA脚手架优化调控了路径关键酶(包括：丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶和富马酸酶)的比例，借助ADP依赖型的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和NAD+依赖型的甲酸脱氢酶协调优化了胞内的辅因子平衡，最终在5 L发酵罐上工程菌株T.G-4G-S(1:1:2)-P(M)-F(H)的富马酸最高产量达到了21.6 g/L。本研究所采用的研究思路和设计方法对于其他化学品的高效合成具有一定的参考价值，同时对代谢工程中合成路径的优化调控研究也具有一定的借鉴意义。