PC-732与ClMCA1互作调控玉米抗弯孢叶斑病的分子机制研究

In previous study, a new microRNA: PC-732 related to disease resistance was found. However, the molecular mechanism to resistance regulated by PC-732 and its target genes is still unknown. In this project, we use PC-732 and its target gene as the research object. Firstly, we analyze the expression pattern of PC-732 in interaction between maize and Curvularia lunata by quantitative PCR and Northern blot technology, and confirm the PC-732 function in the resistance to Curvularia lunata through over expression and anti-miRNA silencing of PC-732. Secondly, we reveal the targeting relationship and regulatory mechanism between PC-732 and target genes ClMCA1 using 5`-RACE, negative correlation, mRNA degradation and protein translation inhibition analysis. Then, we compare interference role to pathogen invasion on difference stages、H2O2 accumulation，cell death, ROS scavenging enzymes, lesion formation size, expression of defense genes in wild type plants, ClMCA1 overexpression and gene deletion mutants, and analyze the relationship between ClMCA1 and PCD, combined with transcriptome technology, and explore the molecular mechanism of ClMCA1 gene in regulation of plant resistance. The results will reveal the new mechanism of PC-732 in resistance to Curvularia lunata, and provide theoretical foundation and technical support for cultivating resistant varieties of maize.

课题组前期研究发现一个可能与抗病相关的新microRNA: PC-732，然而目前关于PC-732调控抗病性的分子机制尚无人研究。本项目以PC-732及其靶基因为研究对象，采用定量PCR和杂交技术分析PC-732表达模式，通过超量表达和基因沉默技术，明确PC-732在抗病性中的功能；采用5`-RACE、表达负相关性、mRNA 降解、蛋白翻译抑制和亚细胞定位，揭示PC-732对ClMCA1靶向关系和调控机理；比较野生型植株、ClMCA1超量表达和基因缺失突变体对病菌侵入不同阶段的干扰作用、H2O2积累、细胞死亡、ROS清除酶、病斑形成大小、防卫基因表达的影响、ClMCA1与PCD的关系，并结合转录组技术，研究ClMCA1基因调控抗病性分子机制，探讨ClMCA1基因在调控抗病性中的分子机制。研究结果将揭示PC-732抗玉米弯孢叶斑病菌的新机制，为我国培育玉米抗病品种提供理论基础和技术支撑。

解析玉米抗弯孢病菌的分子机制，为我国快速培育玉米抗病品种提供理论依据和研究价值。miRNA作为信号传导网络上游的调控因子，那么miRNA在玉米对弯孢病菌抗病反应中发挥什么样的作用，目前并不清楚。通过高通量测序技术鉴定了玉米与弯孢亲和和非亲和过程的关键microRNA: PC-732，采用生物信息学技术预测了PC-732的靶基因为（ClMCA1），采用stem-loop RT-PCR技术发现PC-732在抗病品种3hpi和15hpi有两个表达高峰，并且到达峰值的时间要早于感病品种，伴随着峰值的到来PC-732的靶基因也呈现下调模式，然而在感病品种中PC732在15hpi到达峰值，但其靶基因却无下调表达，推测在感病品种中PC732可能对靶基因CIMCA1没有调控；进一步利用荧光定量PCR 技术和烟草共表达技术揭示了PC-732可以剪切ClMCA1靶基因，呈现负相关调控模式。采用基因功能研究技术获得PC-732超表达和抑制表达突变体，发现抑制PC-732表达可以提高玉米对病菌的抗病性，超表达PC-732比对照更加感病；进一步采用比较转录组学技术分析了转基因OE732和STTM732玉米植株的差异表达基因中的metacaspase基因家族，发现在OE732转基因植株中只有基因gene-LOC100193173（metacaspase1）呈现差异表达且具有下调表达趋势，与野生型对照相比下调表达0.65倍，而在STTM732转基因玉米植株中有8个metacaspase基因呈现差异表达水平，并且基因gene-LOC100193173（metacaspase1）呈现上调表达，与野生型相比上调表达2.56倍，同时metacaspase基因家族其他转录本的表达也受到一定的影响。经过比对分析发现miRNA PC-732仅与基因gene-LOC100193173（metacaspase1）互补配对，因此gene-LOC100193173（metacaspase1）为PC-732的靶基因，并且PC-732对gene-LOC100193173行使剪切作用。以上结果表明miRNA PC-732通过调控metacaspase1，负调控玉米对弯孢叶斑病菌的侵染和抗病性，揭示了PC-732对玉米弯孢叶斑病菌的分子调控机理, 为我国快速培育玉米抗病品种提供理论基础和技术支撑。