玉米弯孢叶斑病菌Clg2p效应分子的鉴定及其在致病性中的调控作用

Clg2p蛋白在玉米弯孢叶斑病菌致病性中的调控分子机理尚无人研究。本研究采用酵母双杂交系统、荧光定量PCR（Q-PCR）技术和生物信息学，以Clg2p效应分子结构域构建诱饵蛋白载体，从玉米弯孢叶斑病菌酵母双杂交cDNA文库中筛选出Clg2p候选效应分子后，通过Pull-down蛋白体外互作和Western blotting实验鉴定出Clg2p效应分子；利用基因敲除技术获得其效应分子敲除突变体，通过比较ΔClg2p突变体（前期实验获得）、效应分子敲除突变体与野生型菌株CX-3在致病性方面表现的差异，结合Q-PCR结果，综合分析出Clg2p蛋白与其效应分子的互作在病原菌致病性中的作用，明确Clg2p蛋白水平的调控分子机理，为全面揭示该病原菌的致病机制奠定基础。

本项目通过酵母双杂交技术，以Clg2p基因为诱饵蛋白，从玉米弯孢叶斑病菌酵母双杂交cDNA文库中筛选出57个与Clg2p互作的阳性克隆，通过回交实验和测序获得了7个互作基因，它们分别为为尿酸氧化酶 （命名为ClUase）、MAPKKK(命名为Clf)、细胞壁水解酶、锌指转录因子ace1、乙酰辅酶A合成酶基因和2个假定蛋白。采用定量PCR技术在Clg2p基因敲除突变体(前期实验获得)检测这些基因的表达水平，结果表明ClUase和Clf基因表达水平下调，推测它们可能是Clg2p下游效应分子。利用靶标酵母双杂交技术和双荧光定位技术 (BiFC)进一步证明了Clg2p可以在酵母和植物细胞中与ClUase和Clf发生相互作用。通过基因敲除技术获得ClUase和Clf敲除突变体，通过PCR技术和Southern bloting技术鉴定了敲除突变体；通过综合比较野生型菌株CX-3、ΔClg2p敲除突变体和效应分子ΔClUase、ClfΔRA和ΔClf敲除突变体在致病性、孢子形态、产孢量、菌丝生长，附着胞形成和形态以及致病性等方面的差异，表明Clg2p可以通过Clf 的RA结构域调控病菌的附着胞形成和形态及致病性，与ClUase互作调控病菌孢子形态。该研究结果深入地揭示了Clg2p蛋白在玉米弯孢叶斑病菌中分子调控机理。