EHEC O157:H7 HCP与ficolin 3互作抑制凝集素补体激活系统的分子机制

HCP of IV pili is an important virulence factor of EHEC O157:H7 and ficolin 3 is one of key complement molecules. Interaction of HCP with ficolin 3 inhibits lectin complement activation system, but the molecular mechanism and fine structural basis between them is unclear. In this study, we will start research from three aspects to elucidate the mechanism. First of all, prepare segmental expression of HCP and ficolin 3 proteins and displaced key amino acid expression of HCP and ficolin 3 proteins to study effect on key complement moleculars and their receptors in lectin complement activation system. And, to study key protein changes in the signal cascades of MBL-mediated complement activation system and classical complement activation system. Finally, to study fine structure of HCP and ficolin 3 dimer using technology of protein crystallization and X-ray, in order to explain how HCP changes ficolin 3 structure and inhibits ficolin 3 role as a complement member. These results and theory obtained in this study will deepen interpretation of EHEC O157: H7 HCP pathogenesis and HCP-mediated immune escape mechanisms, further clear the interaction relationship between parasite of EHEC O157: H7 and host defense mechanisms.

IV菌毛HCP是EHEC O157:H7重要的毒力因子，胶原纤维素ficolin 3是凝集素补体激活系统关键的补体分子，HCP与ficolin 3互作，对宿主补体系统起到抑制效应，但二者互作的精细结构和分子基础尚不清楚。本项目拟从三个方面阐释HCP与ficolin 3互作抑制补体激活系统的分子机制：（1）表达HCP和ficolin 3不同片段蛋白和氨基酸位点突变蛋白，研究HCP与ficolin 3互作对凝集素补体激活系统节点分子和受体表达的影响。（2）HCP与ficolin 3互作对MBL介导凝集素补体激活系统和经典补体激活系统的影响。（3）HCP与ficolin 3蛋白结晶和X射线检测，分析二者互作精细结构。本研究获得的结果和理论将深入诠释EHEC O157:H7的致病机制，并指导病原菌的有效防控。

肠出血性大肠杆菌（Enterohemorrhagic Escherichia coli, EHEC）O157:H7是重要的食源性病原菌，感染动物大多为无症状带菌状态，但常以低剂量感染人类而导致严重的临床症状。IV菌毛是一个多功能蛋白，是病原菌重要致病因子之一，但IV型菌毛在EHEC O157:H7致病过程中如何发挥作用，尚不清楚。EHEC O157:H7的IV型菌毛命名为HCP。前期研究发现HCP除与宿主细胞表面某些膜蛋白、糖基或者脂类结合，介导粘附和侵入外，还可与补体分子FCN3结合，这种结合干扰了宿主的内源性免疫，介导了病原菌免疫逃逸，但分子机制尚不明确。鉴于此，本项目开展以下研究：①HCP与FCN3不同区段之间的互作：HCP和FCN3主要互作区段位于HCP的C端25个氨基酸。②HCP与FCN3不同区段之间互作后，对补体激活系统的影响：MBL与FCN3是凝集素补体激活系统中重要的分子，二者具有与HCP基本相当的结合活性，抑制补体系统的激活；HCP与经典补体激活系统C1q没有结合活性；HCP与补体系统中其他分子，如C3，没有明显的结合活性。③基因敲入小鼠感染试验和尝试分析HCP/FCN3聚合蛋白互作结构：成功繁养FCN3+小鼠和FCN3-小鼠。对于FCN3+小鼠，EHEC O157:H7野山株（WT）与HCP缺失株（mHCP）相比，致病力和结肠重量，无显著差异，小鼠解剖也无显著差异；但对于野生小鼠（FCN3-小鼠），WT的致病力显著强于mHCP；肠子重量显著高于mHCP。根据GenBank已有FCN3结构和模拟的HCP，明确了二者互作的动态空间构像。本项目不仅明确了EHEC O157:H7 IV菌毛与FCN3互作抑制补体激活系统的机制，丰富了EHEC O157:H7的致病机制，而且HCP主要功能区段的25个氨基酸可以作为靶向多肽，研发自身免疫免疫性疾病治疗用制剂。