巴氏醋杆菌乙偶姻代谢机理研究

Acetoin is an important flavor substance in vinegar with a higher content. The metabolism of acetoin is closely related to that of acetic acid in bacteria. Acetoin is also the precursor of Ligustrazine, the typical functional component of Chinese traditional vinegar from solid fermentation. Acetobacter pasteurianus is the typical microorganism that converts ethanol to acetic acid in Cupei. There were few reports on the metabolism of acetoin and its molecular mechanism is not clear to date. In the previous research of this project, we have sequenced the complete genome of an A. pasteurianus strain from Cupei. The comparative genome analysis of this strain with that of another 13 A. pasteurianus strains in NCBI database revealed that A. pasteurianus has not only a unique and conservative acetoin synthesis gene cluster but also a very different acetoin cleavage gene cluster when compared with other bacteria. In this project, we will study the transcription and regulatory of acetoin metabolism genes and the changes of metabolism flows. We also plan to clone, express and purify the key enzymes and determinate the properties of the enzymes and simulate and validate the intracellular pathways using the purified enzymes. Gene knockout and replenishment experiments will also be performed to investigate the physiological significance of the acetoin metabolic pathway to the species of A. pasteurianus. This project will help to understand the metabolism mechanisms in A. pasteurianus and mine unknown functional genes and enzymes, which will provide references for the regulation of vinegar brewing process, development and utilization of microorganisms from traditional brewing industry.

乙偶姻是食醋中的一种重要风味物质，含量较高，其代谢与乙酸密切关联，且是固态发酵食醋标志性功能成分川芎嗪的前体。巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus, Ap)是醋醅中将乙醇转化为乙酸的典型微生物，关于其乙偶姻代谢研究非常少，分子机理尚不清楚。本项目在前期研究中，对1株Ap食醋生产菌进行了基因组测序，并与NCBI数据库中已有13株Ap菌进行了比较，发现这一物种具有独特而保守的乙偶姻合成基因簇，并且其乙偶姻分解基因簇也与已知细菌不同。本项目将研究Ap菌在不同条件下乙偶姻代谢基因簇的转录与调控机制及产物与代谢流变化；克隆表达纯化关键酶，测定酶学性质，利用各个纯酶在体外组合，模拟验证Ap胞内途径；通过乙偶姻代谢基因敲除与回补，研究乙偶姻途径对Ap这一物种的生理意义。本项目有助于理解Ap菌代谢机理、挖掘未知基因和功能酶，为调控食醋酿造过程、开发利用传统酿造功能微生物提供借鉴。

乙偶姻是固态发酵食醋中第三大挥发性成分，其含量直接影响食醋风味；另外，乙偶姻代谢与乳酸、乙酸等代谢密切关联，并且乙偶姻是食醋中川芎嗪等重要杂环化合物的前体。川芎嗪具有扩张血管、抑制血小板聚集、防止血栓形成、改善脑缺血等多种保健作用，被列入“地理标志产品—山西老陈醋”国标（GB/T 19777-2013）中，但经实测，7成多山西老陈醋产品中川芎嗪含量有待提高（实测51种，达标14种）。关于食醋中乙偶姻来源的研究报道较少，巴氏醋杆菌是醋醅中将乙醇转化为乙酸的典型微生物，关于其乙偶姻代谢研究非常少，分子机理尚不清楚，这妨碍了从根本上提高改善食醋品质。本项目对1株食醋生产巴氏醋杆菌进行了基因组测序，并与NCBI数据库中已有巴氏醋杆菌进行了比较基因组学研究，发现这一物种具有多个独特的乙偶姻代谢基因，因此，本项目系统研究了巴氏醋杆菌中乙偶姻的合成、分解、调控机制、生理作用，包括巴氏醋杆菌中与乙偶姻合成相关的重要结构基因功能、与乙偶姻分解相关的重要结构基因功能、与乙偶姻代谢调控相关的重要基因功能及乙偶姻代谢对巴氏醋杆菌的生理作用等，揭示了巴氏醋杆菌中乙偶姻代谢机制、生理作用，研究了多个未知基因和功能酶。通过本项目的研究，对食醋酿造关键微生物巴氏醋杆菌中乙偶姻的合成、分解、调控机制、生理作用等有了深入细致的认识，发现并阐明了一种新型的乙偶姻合成代谢基因簇和多个乙偶姻代谢功能酶，另外构建的acoA基因缺失工程菌株不再分解乙偶姻，这非常有利于川芎嗪的积累，在食醋酿造过程中有重要潜在应用价值。.另外，在保障项目经费充足用于原定研究内容之外，还拓展研究了枯草芽孢杆菌同时高产乙偶姻和纳豆激酶、从自然界筛选新颖可能产乙偶姻的菌株、用凝结芽孢杆菌产乙偶姻和川芎嗪、野生型芽孢杆菌产手性乙偶姻能力、芽孢杆菌产新型乙偶姻相似化合物等，均发表了研究论文或申请了专利。