巴氏醋杆菌131-X539高耐酸机理与群体感应的研究

醋酸菌的耐酸性是制约酸性条件下发酵过程的关键因子。采用膜片钳、细胞群体感应、流式细胞分析、蛋白组学等新技术和方法，对高耐酸（126g/L）巴氏醋杆菌131-X539单细胞膜膜电流/电压，内膜/外膜醋酸根通道差异、H+传递与能量代谢、膜流动性与通透性、膜内外pH响应、差异蛋白，以及多细胞群体感应（Quorum sensing, QS）解析、群体感应基因(aceRI)克隆表达与功能、QS激活与淬灭分子信号高能量筛选等进行重点研究，同时结合第二信使分子及高醋酸下细胞细胞凋亡研究和耐酸性标志基因乙醇脱氢酶基因进化计算，阐明巴氏醋杆菌131-X539耐酸性细胞膜分子机制及群体感应规律，为醋酸菌及其细胞膜在工业发酵、生物转化与生物电池等方面的研究提供理论指导，为醋酸菌及其它食用产酸细菌（如乳酸菌、丙酸菌）的工业育种提供新策略。

巴氏醋杆菌产酸一般在5-7%（w/v）。目前食品工业等多行业对于高酸度食醋需求急增，我们在浙江传统玫瑰醋中分离筛选到一株高产酸巴氏醋杆菌131-X539(产酸可达12%),以此为对象主要从蛋白组学、细胞膜脂、基因组学等方面对其耐酸性开展工作。（1）蛋白组学研究鉴定了与耐酸性关联的关键蛋白或重要生物过程：氨基酸代谢的脱氨作用对于胞内pH稳定功能；在高酸度下生物过程显著不同，尤其是氧化还原、蛋白合成、脂肪酸合成等过程。这完全不同于往低酸度短时间酸刺激研究中所发现的酸适应机制。（2）细胞膜脂变化是耐酸性的一个重要方面。膜上H+-ATPase的活力随着生长环境中酸度的上升而增强，有利于胞内质子的外排量。酸胁迫下质膜大部分脂肪酸的相对含量均发生了变化，总不饱和脂肪酸（TUFA）、碳原子数大于17的脂肪酸所占比例随酸度的增加而显著增加。环丙烷脂肪酸随酸度上升表现出先增后降规律；细胞膜流动性总体上增强，初步关联了不同醋酸条件下细胞形态、膜流动性的变化规律。对环丙烷脂肪酸合成酶基因进行克隆与敲除，研究其对细菌耐酸性的关系。首次采用脂质组学方法详细表征了酸适应过程脂质变化，新发现了一些独特的脂质，相关数据正在整理中。（3）巴氏醋杆菌作为一个整体如何响应外部酸压力？比较基因组学揭示巴氏醋杆菌种群在基因进化过程丢失了群体感应AI-1信号分子高丝氨酸内酯类AHLs合成基因以及AI-2合成基因，其不含有革兰氏阴性细菌常用QS系统；但其可产生Ala-Pro等环肽类，此类环肽是否有QS效应未证实。c-di-GMP的合成酶结构域比较表明巴氏醋杆菌种群中也不存在此信号分子合成能力。推测巴氏醋杆菌与葡糖醋杆菌具有完全不同的群体感应信号。比较醋酸菌的双组份系统、CRISP-Cas，及毒素与抗毒素，表明其与巴氏醋杆菌耐酸性及生态进化存在重要关联，为后续研究提供了方向和基础。（4）巴氏醋杆菌的低生物量是工业产酸强度低的主要原因。本研究首次发现了巴氏醋杆菌以形成持留来对抗酸压力，酸压力下种群形成异质群体。（5）PQQ-ADH是醋酸发酵的直接关键酶。PQQ及ADH的合成基因进行了比较研究，结果表明醋杆菌中存在较大差异。但其结构与耐酸性之间还发现显著关联性。巴氏醋杆菌耐酸性是多方面共同适应的结果，本研究首次阐述了几种新种耐酸机制，为巴氏醋杆菌工业菌种改良及优化培养条件提高产酸强度提供了有力的理论指导。