硫色曲霉纤维素酶分子结构与催化机理研究

The cellulose in plant feedstuff is difficult to be degradation by pigs, chickens and some other single stomach animals and prevent the digestion and absorption of other nurients, reducing the nutritional value of feedstuff, wasting the limited feed resources. Cellulase is the general name of enzymes that hydrolyze cellulose, including exo-β-1,4-glucanase, endo-β-1,4-glucanase and β-glucosidase. The synergistic reaction of these three enzymes can hydrolyze cellulose completely. At present, the catalytic mechanism of cellulase is not clear. The wild type strain have the defects of low fermentation activity and easy degeneration, thus limited its application in the feed industry. The applicant’s laboratory isolated Aspergillus sulphureus strain that secrete cellulase with high activity. On the basis of previous work, we will analyse the composition of the Aspergillus sulphureus cellulase and their molecular structures, clarifying the molecular mechanisms of catalysis. We will also construct the engineering strain with high expression of cellulase, optimize the fermentation techniques, clarify the coordination degradation model of recombinant cellulase for feed ingredients of cellulose in vitro. The research result of this project not only enriches the existing knowledge of cellulase, but also lays foundation for its practical application.

植物性饲料原料中纤维素难以被猪、鸡等单胃动物所降解，而且妨碍其他养分的消化和吸收，降低饲料的营养价值，造成有限饲料资源的浪费。纤维素酶是催化纤维素水解的一类酶的总称，包括外切-β-1,4-葡聚糖酶、内切-β-1,4-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶三个组分，纤维素的完全水解需要这三个组分的协同作用。目前，纤维素酶的催化机理还不甚明确，野生型菌株存在发酵活力低、容易退化等缺点，限制了其在饲料工业中的应用。申请人所在的实验室分离了一株硫色曲霉，能够诱导产生高活性的纤维素酶。项目拟在前期工作的基础上，解析该硫色曲霉纤维素酶系组成和分子结构，阐明其催化作用的分子机理；研制高效分泌表达纤维素酶各组分的工程菌株及其发酵工艺，明确重组纤维素酶对于饲料原料中纤维素的体外协同降解模式。项目的研究成果不仅可以丰富现有纤维素酶的知识，更可以为其实际应用奠定基础。

纤维素酶是一种重要的工业用酶制剂，在饲料工业中也有重要应用。纤维素 酶能够提高饲料消化率、促进营养物质的释放。纤维素酶是催化纤维素水解的一类酶的总称，包括外切-β-1,4-葡聚糖酶、内切-β-1,4-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶三个组分，纤维素的完全水解需要这三个组分的协同作用。本项目系统研究了硫色曲霉纤维素酶的组成和分子机构。通过全基因组序列分析，明确了硫色曲霉纤维素酶系组成，在该基因组中，找到新纤维素酶基因26条，其中内切纤维素酶基因10条，外切纤维素酶基因5条，β-葡萄糖苷酶基因11条；本项目利用转录组高通量测序技术，测试了不同底物对硫色曲霉表达纤维素酶基因的影响，得到了多个硫色曲霉纤维素酶基因在不同碳源上的表达丰度及表达差异；本研究根据高通量测序的结果，新发现了硫色曲霉中β-1，4-葡萄糖苷酶，命名为bgl T2，并通过毕赤酵母进行了表达。异源表达的bgl T2的最适温度和最适酸碱度分别为55℃和pH 5.5。在含有纤维素的平板上培养硫色曲霉时，硫色曲霉上调一条内切纤维素酶基因和一条外切纤维素基因的表达。这两个酶分别被命名为EG T9和CBH T4。CBH T4 mRNA含有1206 bp，酶编码401aa。CBH T4属于糖基水解酶家族6，其对微晶纤维素在pH 5.0和45℃的条件下有最佳活性。EG T9基因的编码序列为1179 bp，酶编码392 aa, 属于糖基水解酶家族5，最适温度为75℃，最适酸碱度为5.0。开展了硫色曲霉纤维素酶协同作用效果研究。完成了一种厌氧酶解复合中药渣制备仔猪抗腹泻饲料的方法。以干姜药渣、陈皮药渣和苍术药渣为药物原料，与仔猪饲料原料混合后，添加红糖、纤维素酶和半纤维素酶，加水调节其含水率为30-50%，接种酵母菌和乳酸菌后混匀，在密闭环境下，酶解发酵即得。利用纤维素酶和半纤维素酶协同酶解，从而高效释放药物原料中的有效成分。项目基本完成了预期的研究目标，执行期间发表研究论文1篇，还有1篇正在修改中；申请发明专利1项。