β-甘露聚糖酶定向进化与催化分子机理研究

β-甘露聚糖酶是一类能够水解含β-1,4-D-糖苷键的甘露聚糖的内切水解酶类。近年来，随着豆类产品在动物饲粮中的广泛应用，研制高比活性β-甘露聚糖酶，消除甘露聚糖抗营养作用越来越受到重视。本项目是在前期工作的基础上，利用易错PCR与DNA改组技术相结合，对硫色曲霉β-甘露聚糖酶进行体外分子定向进化，构建随机突变体文库，利用绿色荧光蛋白标签和底物平板组合，定向筛选高比活性重组β-甘露聚糖酶突变体。根据毕赤酵母密码子偏好性优化设计突变体编码基因序列，构建高效分泌表达重组酶的工程菌株，研究工程菌株的小试发酵工艺和重组酶酶学性质；利用肉鸡饲养试验探讨高比活性重组β-甘露聚糖酶在动物生产中的应用效果；对比重组酶与野生型酶的氨基酸序列的差异，利用定点回复突变技术，研究重组酶高效催化的分子机理。研究成果不仅可以为开发高效饲料酶制剂奠定基础，而且可以为类似酶工程的理性设计研究提供依据，具有重要的科学意义。

β-甘露聚糖酶是一类能够水解含β-1,4-D-糖苷键的甘露聚糖的内切水解酶类。近年来，随着豆类产品在动物饲粮中的广泛应用，研制高比活性β-甘露聚糖酶，消除甘露聚糖抗营养作用越来越受到重视。本项目是在前期工作的基础上，对β-甘露聚糖酶进行体外分子定向进化研究；利用动物饲养试验探讨高比活性重组β-甘露聚糖酶在动物生产中的应用效果；对比重组酶与野生型酶的氨基酸序列的差异，探讨重组酶高效催化的分子机理。.主要研究结果如下：.1、β-甘露聚糖酶的分子定向进化、高效表达及分子机理研究：(1) β-甘露聚糖酶基因突变文库的构建及筛选。以硫色曲霉β-甘露聚糖酶基因为模板，通过易错PCR法随机引入突变，通过底物平板和刚果红染色初筛，筛选出具有高活性的克隆，获得4个酶活比野生型提高的突变体，发酵活力提高了3~4倍。(2) β-甘露聚糖酶工程菌株的构建及表达。各突变体酶摇瓶发酵活性比野生型提高1.5~3倍。将突变体-1高密度发酵，酶活达到8,500 U/mL，比野生型酶的发酵活力提高了近8倍。(3) 突变体酶酶学性质及催化分子机理分析。进行基因序列和氨基酸序列分析可知，4个突变体酶分子中分别有1~3个氨基酸替换。对4株突变体的酶活特性进行比较，突变体-1具有良好的耐热性，甘露聚糖酶表达量及表现性状最为优良。推测可能是由于氨基酸的突变增加了蛋白质的刚性，从而提高了耐热性。.2、添加甘露聚糖酶对猪生长性能和营养物质消化率的影响：(1) 添加甘露聚糖酶显著改善了生长猪的平均日增重和增重耗料比；显著提高了其粗蛋白质、中性洗涤纤维等的表观全肠道消化率；最适宜添加量为400 U/kg。(2) 低能日粮添加甘露聚糖酶后显著改善了平均日采食量和增重耗料比，提高了干物质、粗蛋白质等的表观全肠道消化率。(3)甘露聚糖酶能显著提高肥育猪中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、钙和总能的表观回肠末端消化率。(4) 不同能量水平日粮添加甘露聚糖酶对肥育猪回肠末端营养物质消化率的影响。低能日粮添加甘露聚糖酶后显著提高了干物质、酸性洗涤纤维和总能的表观回肠末端消化率。.课题组成员密切配合，精诚合作，使得项目研究达到了预期目标，发表SCI收录论文1篇，获得国家发明专利授权1项，并实现了该技术的转让，转让收入50万元；培养硕士研究生2名。