纳米化提高中药成分脂质体的免疫增强作用和机理的研究

Researches funding with National Natural Science Foundation of China find that the immunoehancement activity of CHMIs encapsulated with liposome can be obviously improved. The project will further prepare the Chinese herbal medicinal ingredients (CHMI) nano-liposomes and study the immunoehancement activity and mechanism of them. Firstly, various methods will be selected to prepare CHMIs nano-liposomes and the preparation conditions will be optimized. Secondly, CHMIs nano-liposomes, as immunological adjuvant, will be inoculated to animal with avian influenza vaccine and swine fever vaccine, and observe the immune effects of them comparing with regular liposomes. The best immunological adjuvant will be selected. Lastly, the immunoenhancement mechanism of them will be studied with real time PCR, flow cytometry, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and electrophoretic mobility shift assay (EMSA) method, including the lymphocyte proliferation and lymphocyte subpopulations, antibody and antibody subclass, Th1 and Th2 immune balance, functions of dendritic cells (DCs) and macrophage, nuclear factor-Kappa B（NF-κB）DNA binding activity of macrophage and splenocyte. The aim of this strategy is to achieve better immunological adjuvant activity of CHMIs nano-liposomes than regular liposomes and provide the theory basis for further clinical application. It will be not only important to prevent the infectious diseases, but also provide research thinking of modernization of traditional chinese medicine and save resources of traditional chinese medicine.

本项目拟在前一基金项目研究证明脂质体能显著提高中药成分的免疫增强活性的基础上，进一步研究不同制备方法制备的中药成分纳米脂质体及其免疫增强作用和机理。首先采用不同方法将中药成分制备成纳米脂质体，优选出最佳制备方法和条件。然后将中药成分纳米脂质体免疫增强剂与禽流感、猪瘟等疫苗一起免疫，并与普通中药成分脂质体比较，观察其免疫效果，筛选出免疫增强效果最好的纳米脂质体；最后采用RT-PCR、流式细胞仪、Elisa、EMSA等方法测定其对淋巴细胞增殖及其亚群、抗体及其亚类生成、Th1/Th2型细胞平衡、树突状细胞和巨噬细胞功能、树突状细胞和巨噬细胞NF-κB DNA结合活性等的影响，深入研究纳米脂质体的免疫增强作用机理。旨在得到比普通脂质体免疫增强作用更好中药成分纳米脂质体并阐明机理，为免疫增强剂的进一步临床应用提供理论依据。不仅对畜禽疫病的防控具有重要意义，且可以促进中药现代化和节约中药资源提供思路

在前一项国家自然科学基金青年基金项目的研究中，虽已发现中药成分被脂质体包封后其免疫增强活性明显提高，但是所制备的脂质体为普通脂质体，其粒径大，不易被机体全部吸收利用。如将筛选出的具有较好免疫增强活性作用的中药成分制备成纳米脂质体，充分利用纳米脂质体具备有普通脂质体不具备的小尺寸效应和表面效应的优越特性，将更利于中药成分的免疫增强活性的发挥。另外，前期研究对脂质体药物的作用机制的研究仅限于其对抗体效价、淋巴细胞增殖等方面，对于其深入的免疫增强作用机制并不清楚，有也待进一步阐明。本项目在前一个基金项目研究证明脂质体能显著提高中药成分的免疫增强活性的基础上，进一步研究不同制备方法制备的中药成分纳米脂质体及其免疫增强作用和机理。.本项目完全按照计划执行。首先，采用不同方法制备了枸杞多糖纳米脂质体、灵芝多糖纳米脂质体和地黄多糖纳米脂质体，并对其制备条件进行了优化；其次，研究了三种多糖纳米脂质体的免疫增强作用，主要研究了其包封OVA、鸡新城疫疫苗及猪PCV2型病毒疫苗的免疫增强作用；最后探讨了三种多糖纳米脂质体在对树突状细胞功能、巨噬细胞功能、Toll样受体、TLR4/ MyD88/ NF-κB通路等免疫作用机理。.本项目研究发现制备出的三种中药多糖纳米脂质体包封率高，平均粒径均在100-200nm，粒径均一，粒径分散系数低；纳米脂质体形态为类球形，形态均一；包封抗原后具有较好的稳定性，且对抗原具有缓释作用。在作为OVA抗原、鸡新城疫疫苗及猪PCV2型病毒疫苗的佐剂免疫动物后，发现三种中药多糖纳米脂质体均能不同程度的提高机体特异性抗体效价、促进机体产生细胞免疫反应，和临床常用佐剂相比，能更好的延长机体的体液免疫和细胞免疫，具有较好的缓释作用，这对防治畜禽传染病具有重要意义。最后，探讨了三种多糖纳米脂质体发挥免疫佐剂的作用机理，发现多糖纳米脂质体不仅能够提高抗原提呈细胞巨噬细胞、树突状细胞的抗原提呈功能，而且能够促进其分泌细胞因子，其发挥功能主要是依赖TLR4-MyD88-NF-κB通路。本项目研究表明将中药成分制备成纳米脂质体药物后佐剂活性得到明显提高，为开发高效、低毒的免疫佐剂提供了研究基础和方法。.本项目已发表论文12篇，均被SCI论文收录，还有2篇英文在投稿；申报发明专利3项；参加国内学术会议3次，做会议报告3次，获得会议优秀论文2篇；培养研究生6名，4其中4名已经毕业。