基于吡咯螺缩酮生物碱仿生合成的小分子探针构建及抗衰老靶标蛋白的捕获

Novel pyrrole spiroketal alkaloids, isolated from Astrgalus, and also found in Capparis spinosa, Brassica campestris Pollen, Acorus tatarinowii and Xylaria nigripes, were little (ppm) in natural world. Although they have shown dramatic anti-senescent activity, the biosynthetic pathway and the anti-aging mechanism of these alkaloids are still unclear. In this research, we propose that sugar and amino sugar are substrates in the pyrrole spiroketal alkaloids’ biosynthetic pathway and try to realize the biomimetic synthesis. We design chemical probes of pyrrole spiroketal alkaloids with alkynyl moiety and affinity tag. The probes, conjugating with azide-linked fluorescent dyes or biotin by click reaction, identify and capture target proteins in cells. The probes with alkynyl and photoreactive group are designed based on the biomimetic synthesis of natural pyrrole spiroketal alkaloids. The optimization of probes will be done by changing the linker and affinity tags, based on the evaluation of anti-aging activity. After post-lysis bio-orthogonal ligation of reporter or affinity tags, the labeled protein targets will be visualized, separated, affinity purified, digested and tested based on SDS-PAGE and LC/MS. The identification of protein target will be realized via the peptide mass fingerprinting analysis and database search.

在黄芪、刺山柑、油菜花粉、石菖蒲及乌灵参等多种具有抗衰老活性的天然资源中发现含量甚微（ppm级）的吡咯螺缩酮生物碱，其抗衰老活性显著，但生物合成途径和抗衰老靶标尚未阐明。本项目提出吡咯螺缩酮以糖和氨基糖为原料的生物合成途径，拟进行其仿生合成，并构建含有炔基的分子探针，通过点击化学连接报告基团或分离基团，识别并捕获其在细胞内的靶标。在仿生合成已知天然吡咯螺缩酮生物碱的基础上，设计合成含炔基和光亲和基团的分子探针，调节探针分子的连接基团及亲和基团，使探针分子保有抗衰老活性。通过生物正交反应导入报告基团后对靶标蛋白进行可视化、分离、亲和纯化及液相质谱检测，经肽质谱指纹图谱比对及库搜索，最终解析天然吡咯螺缩酮生物碱抗衰老的靶标蛋白。

“基于衰老机制关键环节的小分子药物研究和相关疾病的干预效果评价”是从衰老机制到老年医学的转化医学研究的核心科学问题之一。本项目以具有抗衰老活性的吡咯螺缩酮类天然化合物为对象，研究其仿生合成及抗衰老作用靶标。探索了还原糖与氨基糖在质子酸/DMSO体系、路易斯酸/二氧六环体系、离子液体体系及低共熔溶剂体系中的Maillard反应，均未实现仿生合成。采用活性更高的二氢吡喃酮中间体与氨基糖缩合的方法，由11步反应，得到吡喃糖环吡咯螺缩酮生物碱Pollenopyrroside A和Shensongine A，总收率分别为11.1%和5.5%，制得大量的吡咯螺缩酮用于后期的探针分子合成。受限于吡咯螺缩酮合成的情况，只完成了部分六元糖环吡咯螺缩酮上引入炔基的无亲和基探针分子的合成。.研究中意外发现氨基糖在制备过程中，会被Pd/C催化氧化生成糖吡嗪，且所得果糖嗪具有缓减复制性细胞衰老的活性。使用MTT法测定果糖嗪对 2BS 细胞活力的影响，筛选获得最佳培养浓度为1μM，可以上调细胞活力，为对照组的125%。衰老标志物β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）法对果糖嗪的抗衰老活性进行评价，以1μM果糖嗪连续传代培养衰老早期细胞和衰老中期细胞，其蓝染率降低分别为14%和19%。实验表明果糖嗪对衰老早期或中期的2BS细胞都有抗衰老活性。.合成的吡咯螺缩酮分子探针有限，因此该类化合物抗衰老靶标的探究改用转录组学和蛋白组学的方法。目前已完成2BS细胞复制性衰老模型的探索，筛选出了Pollenopyrroside A和３－OH Pollenopyrroside A对２BS细胞的最佳培养浓度均为0. 1μM。将PD30的2BS细胞分组于培养瓶中培养到52代，每次换液，药物组均加入含0.1 μM 药物的MEM培养基，空白组加入MEM培养基进行培养。统计表明空白组蓝染率为62%，Pollenopyrroside A组蓝染率为29%，3-OH Pollenopyrroside A组蓝染率为38%。实验结果表明两个化合物均可以延缓2BS细胞衰老，且Pollenopyrroside A效果更显著。选择Pollenopyrroside A用于后续转录组学和蛋白组学的研究，在结题后继续完成其抗衰老靶标的研究。