拟穴青蟹Sp-SPH蛋白致病菌模式识别特性及其抗菌机理研究

含SPH结构域蛋白通过识别致病菌与转导免疫信息参与节肢动物免疫调理和酚氧化酶原系统激活，因此对宿主抗致病菌感染具有重要作用。而含SPH结构域蛋白在蟹类中是否具有类似功能尚未见报道。前期研究从拟穴青蟹中首次分离到Sp-SPH天然蛋白，并发现该蛋白参与青蟹识别致病性弧菌感染，本项目拟在已确定Sp-SPH基因序列的基础上获得重组蛋白，利用分子生物学方法与免疫学方法研究Sp-SPH蛋白免疫调理不同致病菌的差异性，确定其致病菌模式识别特性；进一步分离Sp-SPH蛋白互作蛋白，揭示Sp-SPH蛋白参与免疫调理和酚氧化酶原系统激活的免疫信息转导过程；并通过RNA干扰抑制Sp-SPH基因表达，分析青蟹抗致病菌感染的存活率差异，从而揭示由Sp-SPH蛋白介导的致病菌模式识别能否增强青蟹抗致病菌感染的保护力。该研究将首次阐明蟹类中含SPH结构域蛋白作为抗菌免疫识别分子的新功能，为蟹类有效抗菌防制提供新思路。

含SPH结构域蛋白通过识别致病菌与转导免疫信息参与节肢动物免疫调理和酚氧化酶原系统激活，因此对宿主抗致病菌感染具有重要作用。而含SPH结构域蛋白在海洋蟹类中是否具有类似功能尚未见报道。通过本项目实施，取得如下成果：.①构建了Sp-SPH 基因的真核重组表达载体pPIC9K-Sp-SPH，纯化获得重组表达Sp-SPH 蛋白。.②检测体外重组表达Sp-SPH 蛋白识别不同病原菌的结合活性，发现重组Sp-SPH 蛋白能够识别多种病原菌（嗜水气单胞菌等）；ELISA 检测Sp-SPH 蛋白与细菌或真菌细胞壁组分结合特性实验发现Sp-SPH 蛋白能够识别并结合细菌细胞壁组分LPS、PGN 及真菌细胞壁组分β-1,3-葡聚糖，其结合能力具有一定的蛋白浓度相关性。.③酚氧化酶原系统激活实验显示：含Sp-SPH 蛋白样品的酚氧化酶活性为血细胞裂解上清液（HLS）对照样品的2.5 倍，并具显著性差异（P<0.05）。证明Sp-SPH 蛋白识别病原菌后能够激活拟穴青蟹重要先天免疫防御系统-酚氧化酶原系统，从而确定Sp-SPH 蛋白是青蟹酚氧化酶原系统激活的重要辅助因子。.④ Sp-SPH 重组蛋白能够促进拟穴青蟹血细胞的粘附活性，并具有一定程度的浓度相关性，显微镜观察结果也表明该浓度Sp-SPH 蛋白样品中的血细胞粘附数量明显多于对照组。.⑤分别选取嗜水气单胞菌（与Sp-SPH 蛋白较强结合）、副溶血性弧菌（与Sp-SPH 蛋白较弱结合）和解藻弧菌（不与Sp-SPH 蛋白结合）与Sp-SPH 蛋白共孵后感染拟穴青蟹，发现嗜水气单胞菌和副溶性血弧菌感染组动物的累计死亡率明显低于未加Sp-SPH 蛋白处理的细菌感染组动物，且副溶血性弧菌感染的Sp-SPH 处理组中20%以上实验动物存活至7 天以上；而解藻弧菌感染的Sp-SPH 处理组与对照组的累计死亡率无明显差别，表明Sp-SPH 蛋白够增强拟穴青蟹抵御特定致病菌感染的保护力。.⑥确定了Sp-SPH蛋白与抗菌肽Sp-ALF蛋白协同作用而增强青蟹抗病原菌感染能力。.综上，该研究首次阐明海洋蟹类中含SPH结构域蛋白作为抗菌免疫识别分子的新功能，为蟹类有效抗菌防制提供新参考。相关研究成果以本项目资助基金为第一标注在JCR 1 区和JCR 2区各发表1篇SCI国际权威期刊收录论文，获授权国家发明专利2项。