自噬抑制对虾白斑综合征病毒（WSSV）感染的分子机制研究

Autophagy is an evolutionarily conserved intracellular degradation process that ensures the metabolic balance and homeostasis of cells.Recent studies have shown that autophagy plays a key role in host-virus interactions. Previously, we have found the autophagosome containing WSSV virons in haemotopietic tissue (Hpt) stem cells of the red claw crayfish post the viral infection, and the cells with high autophagy activity could clearly inhibit WSSV infection. However, the mechanism is unclear. To elucidate the molecular process involved in the autophagy against WSSV infection, the red claw crayfish will be employed as a model for the functional study by using molecular and cellular techniques, including GFP-Atg8 labeling, autophagy flux analysis, cell membrane/organelle labeling, proteomics analysis, autophagy-related genes overexpression/silencing and chemical drugs treatment. This investigation will focus on: 1)Where does the membrane sources of WSSV-autophagosome come from? And in which way are the key molecules such as Cq-Atg8 involved in this process? 2)How the WSSV-autophagosome fuse with lysosome? 3) What will happen to the WSSV after the fusion of WSSV-autophagosome with lysosome? The findings will provide new insights into how the antiviral autophagy is manipulated against WSSV infection and further shed light on how to control the viral diseases efficiently in aquaculture.

自噬是生物进化过程中保留下来的一种细胞蛋白和细胞器的循环利用机制，近期研究表明自噬在宿主-病毒互作中发挥重要作用。前期研究中我们在对虾白斑综合征病毒（WSSV）感染后的红螯螯虾造血组织干细胞中观察到包裹有完整WSSV粒子的自噬体（WSSV-自噬体），并发现细胞高自噬活性明显抑制WSSV感染，但该生物学现象背后的分子基础及其调控机制尚不清楚。为揭示自噬参与细胞抵御WSSV感染的分子机制，本项目拟以红螯螯虾为模型，利用GFP-Atg8自噬体标记、自噬流分析、细胞膜/细胞器标记、iTraq分析、自噬关键基因过表达/敲降等技术，结合自噬激活剂/抑制剂处理，开展如下研究：1）WSSV-自噬体膜来源及其形成的关键分子基础分析；2）WSSV-自噬体与溶酶体融合方式解析；3）WSSV-自噬体与溶酶体融合后的病毒归宿鉴定。本项目成果将丰富自噬调控细胞抗病毒过程与分子机制的基础理论，并获得抗WSSV新靶标。

自噬是生物进化过程中保留下来的一种细胞蛋白和细胞器的循环利用机制，近期研究表明自噬在宿主-病毒互作中发挥重要作用。前期研究中我们在对虾白斑综合征病毒（WSSV）感染后的红螯螯虾造血组织干细胞中观察到包裹有完整 WSSV 粒子的自噬体（WSSV-自噬体），并发现细胞高自噬活性明显抑制 WSSV 感染，但该生物学现象背后的分子基础及其调控机制尚不清楚。为揭示自噬参与细胞抵御 WSSV 感染的分子机制，我们首先利用细胞学和分子生物学技术分析WSSV入胞及其随后的胞内运输的整个动态过程，包含了病毒的粘附、内化、转运、核酸逃逸及其入核的不同阶段监测，并从细胞层面明确WSSV感染的整个过程和每个关键感染时间节点所发生的重要细胞学事件及其细胞内的物理空间位置。同时，结合转录组分析克隆得到细胞内囊泡转运过程中的关键标记分子，以解析WSSV在感染Hpt细胞过程中含WSSV囊泡的转运定位，并尝试阐明细胞内体系统参与WSSV感染的供给机制：1) 细胞内体系统及酸性囊泡参与细胞内转运WSSV； 2) 自噬在胞内分选转运WSSV过程中发挥抗病毒感染防御功能； 3) CqVCP功能障碍阻断细胞内体转运WSSV，并引发CqGABARAP介导的细胞自噬清除含WSSV内体； 4) WSSV通过CqVCP调控内体逃逸自噬性降解介导的抗病毒效应。通过上述研究，我们首次发现WSSV利用细胞内体系统实现病毒的胞内运输转运并逃避自噬-溶酶体降解途径，该过程中受到CqVCP 分子的正向调控，特别是证明了细胞自噬在WSSV入胞后的感染进程中发挥重要的抗病毒免疫防御功能。上述相关研究发现必将有助于我们设计有效抵御WSSV早期感染的策略。