基于蛋白质组及转录组的卡利比克毕赤酵母降解展青霉素的分子机制研究

Patulin is one of the mycotoxins that can cause the most serious health problems, which has been identified in various fruits and fruit products throughout the world. Controlling and degradation of patulin on fruits and fruit products using antagonistic yeasts has represented a promising future, however the researches are just beginning, especially the molecular mechanisms of biodegradation of patulin by antagonistic yeast is unclear yet, which seriously limit the application of antagonistic yeasts on controlling and degradation of mycotoxins of postharvest fruits . In this study, a Pichia carribica strain which was isolated by our research team will be selected as the model strain. The change in expression of transcriptome and proteomes of P. caribbica involved in degradation of patulin will be analyzed. The genes and enzymes which are related with degradation of patulin will be selected by references in combination with bioinformatics. The function of the relevant genes will be analyzed by building mutant, over-expressed and exogenous expression strains, and investigating their activities of degradation of patulin, The mechanisms of response and regulation of P. caribbica to patulin will be investigated, so that to reveal the molecular mechanisms of degradation of patulin by P. caribbica. The expected research results will provide theoretical evidence for the application of antagonistic yeasts to control and degrade mycotoxins of fruits and its products.

展青霉素是对人类危害最大的真菌毒素之一，其对水果及其制品的污染在全球范围内都很严重。采用拮抗酵母控制并降解水果及其制品中的展青霉素已展现出良好的应用前景，但相关研究尚处于起步阶段，特别是拮抗酵母降解展青霉素的分子机制尚不明确，这严重影响了拮抗酵母在水果采后真菌毒素控制及降解方面的应用。本项目拟以课题组前期筛选分离到的卡利比克毕赤酵母为模式菌株，通过对卡利比克毕赤酵母降解展青霉素时的转录组、蛋白质组的变化进行分析，结合文献及生物信息学方法筛选可能参与展青霉素降解过程的相关基因及酶；构建相应基因的突变体及过表达菌株和外源表达菌株，通过检测突变体、过表达菌株和外源表达菌株降解展青霉素的效力，对筛选出的基因进行功能验证；研究卡利比克毕赤酵母对展青霉素的应答调控，从而揭示卡利比克毕赤酵母降解展青霉素的分子机制。本项目的研究成果可以为拮抗酵母在水果及其制品中真菌毒素控制及降解上的实际应用提供理论支撑。

展青霉素（Patulin，PAT）是由扩展青霉等产毒菌株产生的一种对细菌、植物和动物均具有较强毒性的聚酮类次级代谢产物。扩展青霉侵染采后水果及其制品会造成腐败，并在侵染过程中产生PAT。随着对水果采后病害进行生物控制研究的进展，利用拮抗酵母控制并降解水果及其制品中的PAT已经成为学术界研究的热点。课题组筛选到一株卡利比克毕赤酵母（Pichia caribbica），前期研究发现P. caribbica可显著抑制苹果上PAT的积累。此外，P. caribbica还能在体外降解PAT。但是，P. caribbica降解PAT的产物、产物毒性以及P. caribbica降解PAT的分子机制仍然未知，这限制了其实际应用。本项目针对这一问题进行研究，研究内容主要包括：利用高效液相色谱-液质联用技术对P. caribbica降解PAT的产物进行鉴定；研究PAT降解产物的毒性；分别利用基于iTRAQ的蛋白质组学技术和转录组测序技术研究P. caribbica在蛋白和基因表达水平上对PAT的应答调控机制。项目研究结果表明：P. caribbica通过胞外诱导酶降解PAT形成无毒的降解产物。蛋白质组学分析表明，PAT抑制酵母体内参与物质代谢和生物合成等生物过程蛋白的表达；激活参与抗氧化应激蛋白的表达以应对PAT引起的氧化胁迫，维持酵母细胞内的氧化还原平衡。转录组学分析表明，PAT下调了酵母体内参与蛋白质生物合成、氨基酸代谢和碳水化合物代谢等生物过程基因的表达，在一定程度上抑制了酵母的生命活动；激活参与氧化还原过程，对化学物质、毒素胁迫应答等生物过程相关基因的表达，与蛋白质组结果一致。参与P. caribbica降解PAT关键基因—PcCRG1敲除突变体酵母对PAT的降解作用显著降低，而PcCRG1过量表达突变体酵母对PAT的降解作用明显增强。外源表达PcCRG1，并纯化得到PcCRG1酶，该酶在底物S-腺苷甲硫氨酸存在的情况下可直接对PAT进行降解。项目的研究结果为揭示PAT的降解过程提供重要的理论指导，为寻找靶向降解PAT的酶及其编码基因提供了重要信息，可通过基因工程技术对该酶进行大规模生产，进而将其用于食品中PAT的清除。项目的研究结果具有重要的理论价值、应用价值和社会效益。