基于分泌转录因子工程和亚细胞蛋白质组学的毕赤酵母分泌途径改造

外源蛋白在宿主中的分泌能力是影响重组蛋白生产水平的瓶颈因素。目前多采用理性改造的策略改造分泌途径，如过表达目前认为比较关键的蛋白因子，但由于对分泌途径认识的不足，改造效果有限。毕赤酵母是生产重组蛋白最重要的表达系统之一，由于其蛋白分泌能力的限制，导致很多重组蛋白在分泌表达时产量偏低。本研究以毕赤酵母分泌表达重组蛋白为研究模型，提出从表型入手的反向代谢工程改造策略。首先，通过基于Hac1p改造的分泌转录因子工程的手段获得过分泌表型菌株。其次，通过对出发菌株和过分泌菌株在亚细胞水平上的比较蛋白质组学分析，研究胞浆蛋白、内质网和高尔基体蛋白的表达差异，找出限制重组蛋白分泌的关键基因。最后，通过对这些基因的改造，进一步优化毕赤酵母分泌途径。上述工作有望增加我们对毕赤酵母分泌途径的理解，增强对蛋白分泌表型进行定向改造的能力，为解决蛋白分泌这一限制重组蛋白表达的共性问题提供新的思路和手段。

针对真核表达系统分泌能力对于外源蛋白分泌表达水平的限制，本项目以重组毕赤酵母为研究模型，提出以分泌调控因子Hac1p为改造靶点的分泌转录因子工程的改造策略，即通过对Hac1p的定向进化，使受其调控的数百个基因的表达发生改变，并结合高通量筛选从而实现对毕赤酵母分泌途径准确、高效的改造。本项目围绕此改造新策略，建立了一套针对毕赤酵母的文库构建和菌株高通量筛选方法，并初步获得了一系列对于重组蛋白分泌表达有不同促进作用的Hac1p突变文库。同时，结合蛋白伴侣分子水平的表达差异分析，发现了酵母中重要的蛋白伴侣以及其他应对胁迫基因在重组蛋白过表达时显著的上调变化。在以上工作的基础上，识别了一批重要的蛋白伴侣基因，并将其克隆构建了一个小型的蛋白伴侣文库。通过应用此蛋白伴侣文库，成功的使得谷氨酰胺转胺酶在毕赤酵母中的表达水平提高了50～80%。筛选获得了碱性甘露聚糖酶产量提高25%～60%不等的菌株，其中一株菌株发酵罐产量比出发菌株提高了50%以上，使得碱性甘露聚糖酶的产量初步达到产业化水平。为了实现对于毕赤酵母的有效改造，本项目还建立了一种基于宿主适应性的基因敲除策略，使得外源基因的敲除效率提高2倍～100倍。本项目的实施，有助于加深对毕赤酵母分泌途径的理解，提高对毕赤酵母分泌途径的改造能力，进而有助于解决蛋白分泌限制这一表达的共性问题，为提高重组蛋白表达水平提供必需的理论依据和技术手段。该研究的成果同样可以为解决其他真核表达系统的分泌限制问题提供借鉴。