联合CRISPR/Cas9技术的piggyBac定点转座用于神经精神疾病模型基因组编辑研究

Nervous system genetic disorders have familial and permanent characteristic, causing great threat to human health. As the breakthrough of gene location, diagnosis and cloning technique of nervous system genetic disorders, gene therapy is becoming a novel approach to treat diseases by introducing functional genes into the genome or correcting some mutation loci. Currently, CRISPR/Cas9 system is one of the most effective method for gene therapy, but it also exhibits some insufficiency in gene insertional therapy, especially in large DNA fragment insertion. Based on our previous study, piggyBac (PB) transposition system has the potential to overcome this deficiency. By combining the advantages of CRISPR/Cas9 and PB systems, the present study aims to truncate PB transposase (PBase) into two parts (N terminus and C terminus) according to the key amino acids distribution in the protein sequence. We will select the best combination according to activity screening of twelve pairs of the truncated PBase using the FKBP/FRB system, followed by fusing with the dCas9 (dead Cas9) to achieve site-specific transposition. Furthermore, the optogenetics system will be used based on the above constructed platform to set up a light-inducible transposition system. Based on the above researches, we aim to treat genetically anxiety mice in vivo using the new genome editing platform which we established. The present project will develop a site-specific, high-efficiency, and controllable PB transposition system, which can overcome technical deficiencies of DNA insertional therapy and also provide a new pharmacological strategy for the future gene therapy.

随着在基因定位、克隆、基因诊断等方面的突破，基因治疗有望从源头上根治神经系统遗传病。目前，CRISPR/Cas9系统在大片段DNA插入治疗上还存在不足。申请者基于前期piggyBac（PB）转座系统的研究基础，推测该系统可以有效弥补CRISPR/Cas9的上述不足。拟开展以下研究：1）根据PB转座酶（PBase）的关键氨基酸位点将其分割成12对截断体，然后结合FKBP/FRB系统对12对截断体进行活性筛选，从中筛选出活性最高的截断体组合；2）将筛选出来的PBaseN端和C端分别与dCas9（dead Cas9）融合，利用CRISPR/dCas9的高效DNA靶向性实现PB的定点转座；进而结合光遗传学系统实现光诱导的定点转座。3）运用上述技术探索在体基因组编辑对遗传性焦虑症小鼠模型的治疗作用。通过实施本项目将开发一种定点、高效、可控的PB转座系统，为神经精神疾病治疗提供新的思路和技术手段。

基因治疗是当前疾病治疗的研究热点，主要是针对严重危害人类健康的遗传病。随着基因编辑技术的突破性发展，例如CRISPR/Cas介导的基因组编辑技术，纠正错误的遗传信息将成为可能。然而，CRISPR/Cas9系统介导的大片段DNA 插入还有很大的提升空间。为了提高DNA定点的插入效率，本研究从两个方面入手：一方面，利用CRISPR/Cas9的靶向性同时结合piggyBac (PB)转座系统的高效基因组整合能力，开发出一种定点整合的转座子系统。另一方面，利用CRISPR/Cas9来优化传统的由同源重组介导的基因定点插入技术。在转座子定点转座方面，现已建立了PBase转座酶截断体的活性筛选体系，并完成了转座酶的截断体筛选工作，得到了一对活性相对较高的组合。已建立好定点转座的筛选系统，在此基础上构建了定点转座的质粒，dCas9-PBaseN8和dCas9-PBaseC8，然而截断体二聚化是本项目的一个难点，我们一直在优化载体，寻找最佳的定点转座的条件。由于PBase转座酶的晶体结构近期才刚刚得到解析，这为本项目提供了重要指导意义，为截断体的进一步筛选和优化提供了帮助。本项目也会在接下来的时间里继续开展相关的工作，克服所遇到的一些难题。在提高同源重组方面，本项目通过对CRISPR/Cas9系统进行结构优化，在sgRNA原有的茎环结构中融合MS2或Com茎环结构。将转录激活因子及转录抑制因子分别与可以和MS2及Com茎环结构结合的适配子蛋白MCP和COM融合表达。利用CRISPR/Cas9的靶向结合，可以使转录激活因子进一步激活同源重组（HDR）修复相关的蛋白表达，同时利用转录抑制因子来抑制非同源末端连接（NHEJ）相关的蛋白表达。研究表明激活CDK1及CtIP的表达，或是抑制KU70、KU80及Ligase IV的表达，可以显著提高HDR修复效率。如果同时激活CDK1和抑制KU80表达的组合可以最大限度的提高HDR效率，与对照组相比有13倍提高。在体内实验中，定点在 AAVS1和ACTB位点进行EGFP报告基因的插入实验中得到了进一步的验证。本项目还进一步利用Tet/on系统对转录激活因子或抑制因子的表达进行实时调控，从而实现了高效、可控、而且安全的DNA插入，这为后续的基因编辑和基因治疗提供了一个可靠的技术手段。