应用基因敲除小鼠探讨组织蛋白酶D调控血脑屏机制及缺失与血管性老年痴呆症发病关联的研究

Dementia is a progressive fatal neurodegenerative disease. Half of the total dementia patients result from cerebrovascular disease. Studies have shown that cathepsin D expression is down-regulated in vascular dementia (VAD) patients. Furthermore, previously we found that cathepsin D knock out（KO） mice died at day p23±1 and KO mice demonstrated blood-brain barrier damage and inflammatory cell infiltration in brain tissue. Because of some similar pathologies between KO mice and VAD indicating that cathepsin D deletion might be implicated in VAD. The current project aims to clarify the role of cathepsin D deletion in VAD. Study on pathogenesis of VAD might help to design for therapy strategy.

组织蛋白酶D（CTSD）基因缺失小鼠寿命短、繁殖率低，目前仅局限于作为快速衰老动物模型来研究。我们在前期研究中首次发现该小鼠死亡前血脑屏障（BBB）受损；基于我们创立的单细胞分离机联合免疫磁珠技术的快速提取单细胞的方法，结合流式细胞技术首次发现小鼠脑内有大量单核/巨噬细胞浸润。但CTSD基因缺失与BBB受损、单核/巨噬细胞浸润关联的机制尚不明。有报道称:血管性老年痴呆症（VAD）患者的BBB受损。我们发现VAD患者细胞中CTSD表达减弱。基于该小鼠与VAD有已知的（如：小胶质细胞活化等）和我们发现的多处相似的病理改变的考虑，本项目拟利用该小鼠作为VAD研究的动物模型，通过对小鼠CTSD基因缺失对小鼠脑血管结构改变的影响，解析炎性细胞脑浸润的机理，研究炎性细胞脑内浸润后对神经元细胞的破坏作用等一系列研究，对加深CTSD重要生理功能的理解、探寻VAD的病因具有非常积极的意义。

自噬与血管平滑肌细胞（VSMC）功能密切相关，但是关于晚期糖基化终产物（AGEs）之间的联系以及其在AGEs诱导的VSMCs增殖和迁移中的作用我们知之甚少。目前的研究调查了AGEs对VSMCs表型转化和自噬的作用以及潜在的机制。原代大鼠VSMCs使用牛血清白蛋白或AGEs处理。MTT法、实时分析仪和EdU incorporation检测.细胞增殖。使用Hoechst染色和流式细胞仪分析细胞周期。伤口愈合实验和转板迁移实验检测VSMCs迁移。免疫印迹法检测LC3 转变和p62累积。酸性液泡采用AO和MDC染色,组织蛋白酶D(CatD) 通过慢病毒载体转染VSMCs。AGEs促进原代大鼠VSMC以时间依赖的方式增殖和转移。AGEs 显著增加LC3-II转变和p62的表达，以及酸性液泡的积累，后者不被巴伐洛霉A1作用进一步增加。AGEs 以时间依赖模式抑制CatD的表达，而后者的过度表达可阻止AGEs介导的自噬衰减。CatD的过度表达抑制AGEs诱导的VSMCs增殖。 然而，CatD对AGEs诱导的VSMCs迁移没有影响。AGEs可通过CatD减少促进VSMCs的增殖和抑制自噬。