miR-129/S1P3介导内源性BMSCs调控脑缺血再灌注中巨噬细胞极化作用

Treatment of cerebral ischemia has drawn increasing attention in recent years. Our previous study found that sphingosine had protective effect on cerebral ischemia, and it is reported that S1P3 participates in cell chemotaxis and exists on the surface of BMSCs. Reports also showed that intravascular BMSCs could anchor infarcted areas efficiently, therefore it has become our focus that how to mobilize endogenous BMSCs to regulate the immune response in cerebral ischemia. There are possible binding sites between S1P3 and miR-129, moreover, miR-129 expression is positively correlated with the degree of cerebral ischemia reperfusion injury. BMSCs could reduce cerebral injury by down-regulating IL-23/ IL-17 axis, besides others reported that IL-17 could induce macrophage polarization, however both mechanisms remain unclear. Based on the above, there is no report on the regulation of endogenous BMSCs chemotaxis and its effect on macrophage polarization during cerebral ischemia reperfusion. This project intends to solve the following questions: ①S1P3，existed on the surface of BMSCs, could mediate endogenous BMSCs to the perifocal tissue; ②Endogenous BMSCs regulate the macrophage polarization via IL-23/IL-17 axis; ③MiR-129 targets S1P3 to affect neuronal apoptosis and figuring out these questions will provide a new insight into the therapy of cerebral infarction.

缺血后脑损伤的治疗是目前研究热点，前期证实鞘氨醇对缺血性卒中有保护作用，且有报道1-磷酸鞘氨醇受体3（S1P3）参与了细胞趋化，同时S1P3存在于骨髓基质干细胞（BMSCs）表面。研究发现体循环BMSCs可更好锚定损伤靶位，因此如何动员内源性BMSCs调控脑缺血再灌注中免疫反应成为我们关注焦点。前期发现S1P3与miR-129之间可能存在结合位点，miR-129表达水平与脑缺血再灌注损伤程度呈正相关；BMSCs通过下调IL-23/IL-17轴减轻脑损伤，文献表明IL-17可诱导巨噬细胞极化，但机制不明。脑缺血再灌注中通过靶向调控内源性BMSCs趋化及其影响巨噬细胞极化的研究尚无报道。本项目拟解决：①内源性BMSCs表面S1P3介导其趋化至灶周组织；②内源性BMSCs经IL-23/IL-17轴调控巨噬细胞极化；③miR-129靶定S1P3影响神经元凋亡，期待为临床脑缺血治疗提供新思路。

项目背景：S1PR3作为 S1P 的 G 蛋白偶联受体 S1PR1-S1PR5 中的一员，参与体内的多种生物学效应，其在脑缺血再灌注过程中发挥的作用尚不明确。本研究的目的是探索缺血性卒中相关的核心基因，研究其在脑缺血再灌注中的调控机制。 .研究内容：通过GEO下载两个MCAO微阵列数据集，对其进行DEGs的筛选，GO和KEGG分析可能参与的通路， 进行 WGCNA 并筛选出与缺血性卒中有关的核心模块基因，通过 DEGs 与 WGCNA 取交集的核心基因进行PPI网络的构建，最后发现 S1PR3 是红色蛋白质组的主要成员，随后进行 GEO 数据库的人血测序样本验证，tMCAO模型探讨 S1PR3 在I/R中的作用机制，首先观察 S1PR3 在雄性 C57/BL6 小鼠 tMCAO 后不同时间点的表达情况，S1PR3特异性抑制剂 CAY-10444 处理，观察 tMCAO 后梗死体积、神经功能评分、脑水肿含量、尼氏染色、H&E 染色、Fluoro-Jade C（FJC）染色等，使用 Real-timePCR，western blotting，免疫荧光等研究了血脑屏障相关分子 occludin、ZO-1、AQP4、MMP-9 的表达，检测了一氧化氮合酶蛋白亚型 nNOS、eNOS、iNOS 的表达情况，氧化应激指标 NO、SOD、MDA 含量的变化。.重要结果、关键数据及其科学意义：（1）S1PR3 是缺血性卒中的关键蛋白，在脑缺血中是很好的预测指标；（2）抑制 S1PR3 可通过减轻神经元损伤、胶质细胞活化、脑水肿及减少脑梗死体积、降低神经功能评分来改善脑缺血再灌注损伤；（3）S1PR3 参与脑 缺血再灌注后 BBB 损伤的调控；（4）S1PR3参与了脑缺血再灌注后的氧化应激损伤的调控。这为脑缺血再灌注的治疗提供新的策略和研究方向，对今后临床改善患者预后具有积极意义。