凝集素介导的刺参免疫应答机制研究

It is very important to explore the resistance mechanism of Apostichopus japonicas for outbreak of diseases which serious damage to the healthy development of sea cucumber aquaculture industry. Five key lectins had been obtained by transcriptome sequencing and shown up-regulated expression after stimulation by bacteria or viruses, suggesting that these genes may be associated with immunity. In the present study, we focus on lectin and pathogens interaction sites and mechanism of action; effect of lectin in inflammatory of sea cucumber and verified by Elisa and RT-PCR; the protein interactions with lectin and signal transduction pathway. Through the research of this project which will deepen our understanding of the recognition molecular in invertebrate innate immunity; explore the mechanism of immune response mediated by lectin in sea cucumber, and provide a theoretical basis for disease prevention and application in sea cucumber aquaculture.

病毒和细菌性疾病的爆发严重损害了海参养殖业的健康发展，探索刺参抗病机制对病害的防治有重要的意义。我们通过转录组测序获得五种关键凝集素基因。初步研究显示，细菌和病毒刺激后，这些基因均呈现上调表达趋势，表明这些基因可能与免疫相关。本课题将就刺参凝集素开展进一步研究：研究刺参不同类型凝集素识别病原体的作用位点，分析作用方式；研究凝集素基因在炎症反应中的作用，并通过Elisa和Real-time PCR进行验证；研究凝集素相互作用蛋白及信号转导通路。通过本课题实施，能够加深我们对于无脊椎动物固有免疫中识别分子的认识，具有较新的理论意义；揭示刺参凝集素介导的免疫识别作用和免疫应答机理，为疾病防治提供理论依据,为应用研究打下基础。

项目负责人按照课题合同中的研究内容开展相应研究工作，已基本完成任务书制定的预期目标。具体研究结果如下：克隆获得5种仿刺参凝集素和1个Ajcaspase-3的cDNA序列，并完成相应蛋白的原核体外重组表达工作；除AjFL-1在性腺和肌肉中表达较低外，其余5种凝集素的mRNA遍布各个组织；病原（灿烂弧菌）刺激能显著诱导AjFL-1，AjCTL-2，SJL-1，AjGalectin-8的表达，且表达模式不同；制备了4种凝集素和Ajcaspase-3的多克隆抗体；亚细胞定位分析表明AjFL-1主要定位于细胞膜上，同时也在细胞质中有点状分布，AjCTL-2主要定位于细胞质中，Ajcaspase-3主要定位于细胞核中；PAMP及菌结合活性显示，SJL-1在钙离子存在时能够识别多种PAMPs和多种病原微生物，AjCTL-2和AjGalectin-8能够不依赖钙离子优先结合D-galactose和多种病原微生物，AjFL能够识别多种PAMPs和微生物，且与Mannan结合能力最强，AjFL和AjGalectin-8对不同微生物具有不同程度的凝集作用，Ajcaspase-3能够结合多种PAMPs，且对D-galactose和PGN的亲和力高于LPS；AjCTL-2能够在体外展现出与Ajcaspase-3的结合活性，推测AjCTL-2能够调控Ajcaspase-3介导的细胞凋亡；综上推测上述分子可以通过不同途径参与仿刺参免疫应答过程。. 本项目利用分子生物学、免疫学和生物信息学相关技术查明了仿刺参各类凝集素的基因结构与进化关系，揭示了不同凝集素基因在细胞和组织水平的分布、表达模式，验证了重组凝集素蛋白的免疫学活性，推测了它们可能参与的免疫应答途径。研究结果表明仿刺参各类凝集素分子在整个免疫应答中发生功能分化，为深入了解仿刺参不同类型凝集素的功能、分工和作用机制提供了有力依据。