红豆杉bZIP转录因子TmbZIP1对紫杉醇生物合成的调控机制研究

Paclitaxel, only slightly stored in the bark of Taxus species, is an important anticancer agent. However, the scarce wild resources of Taxus mairei and its low content of paclitaxel make it difficult to meet the demand for medical treatment. It is one of the effective methods to improve the contents of secondary metabolites by transcription factors, which can regulate the expressions of multiple genes in metabolic pathway. Researches on transcriptional regulation of paclitaxel biosynthesis had not been reported yet. Based on the cloning of bZIP family transcription factor gene TmbZIP1, we plan to explore the transcriptional regulation mechanism of TmbZIP1 for DBTNBT and other related genes in paclitaxel biosynthesis parthway. To reveal the function of TmbZIP1, its subcellular localization, transcriptional activation and tissue-specific expression would be taken. TmbZIP1 and DBTNBT promoter core binding sequence would be obtained by EMSA and site-directed mutagenesis techniques. Regulation relationship of TmbZIP1 and related genes would be discussed according to their expression changes under MeJA treatment. It would reveal the role of TmbZIP1 in paclitaxel biosynthesis pathway by analyzing paclitaxel contents and expression levels of related genes in TmbZIP1 overexpression and RNAi transgenic Taxus cell lines.

紫杉醇抗癌作用明显，仅微存于红豆杉属植物树皮中。红豆杉野生资源匮乏，难以满足需求。利用转录因子调控代谢途径多个基因的表达是提高药效成分含量的有效方法之一。有关红豆杉紫杉醇合成的转录调控研究尚未见报道。本研究拟在获得南方红豆杉bZIP家族转录因子基因TmbZIP1的基础上，开展TmbZIP1对DBTNBT及紫杉醇合成其它相关基因的转录调控研究，包括：TmbZIP1的亚细胞定位、转录激活活性、组织特异性表达分析，初步揭示该基因的功能；利用EMSA及定点突变技术，确定TmbZIP1与DBTNBT启动子核心结合序列；分析诱导子MeJA处理下该基因及紫杉醇生物合成相关基因的表达变化，探讨该基因对紫杉醇合成相关基因表达的调控关系；TmbZIP1过表达和RNAi转基因红豆杉细胞系的获得及其紫杉醇合成相关基因表达、紫杉醇含量分析，确定该基因在红豆杉紫杉醇合成中的作用，为解析紫杉醇合成调控机制奠定基础。

本研究主要开展了4个方面的研究：1）分析了TmbZIP1 的亚细胞定位、转录激活活性、组织特异性表达，发现TmbZIP1在茎和叶中高表达，表达不受MeJA诱导，蛋白不具有转录激活活性，推测可能不是一个转录因子。2）完成了DBTNBT启动子关键区段的筛选、鉴定及其功能的验证。3）利用酵母单杂交系统，从南方红豆杉cDNA文库中获得了25个可能与DBTNBT 启动子关键区段结合的蛋白基因，并利用EMSA及定点突变技术，证实了其中的TmWRKY1、脂转移酶基因片段、 DNA损伤诱导蛋白基因片段与DBTNBT启动子核心序列结合。4）验证了TmWRKY1在紫杉醇合成中的作用及其对紫杉醇合成相关基因表达的调控关系。包括：发现TmWRKY1定位于细胞核中；证实了TmWRKY1具有转录激活活性；发现TmWRKY1受MeJA诱导上调表达，推测其可能介导了MeJA信号参与调控紫杉醇的生物合成；获得了过表达TmWRKY1的转基因红豆杉愈伤组织，并利用PCR及RT-PCR证实了其转基因特性；发现过表达系OX1-OX4 的紫杉醇含量均高于对照，其中的OX1含量最高，OX2含量最少；亦发现OX1 中TASY、DBAT、GGPPS、DBTNBT表达均明显上调。OX2中DBAT、GGPPS与DBTNBT表达上调。总之，TmWRKY1可通过上调其靶基因DBTNBT及2-3个其他紫杉醇合成关键酶基因表达来提高紫杉醇含量。总之，完成了TmWRKY1在红豆杉紫杉醇合成中的作用及其对紫杉醇合成相关基因的调控关系的研究，为全面解析紫杉醇生物合成的分子调控机制奠定了基础。