miR5298b调控红豆杉细胞紫杉醇生物合成的分子机制

Plant-cell technology is a promising way to produce precious secondary metabolites, while the industrial process was limited by the instability production of taxol during subculture process. The exploration of the taxol synthesis mechanism in cells is helpful to improve the culture level of industrialization. As we all know, miRNA is an important post-transcriptional regulators involving in regulating biosynthesis of metabolites in plants. In our previous studies, a conserved miRNA, miR5298b was identified as an effective regulator of taxol biosynthesis, network analysis indicated that miR5298b was more likely to affect the expression level of transcription factors to regulate the taxol biosynthesis. Here, we use two subcultured cell lines, CA (low-content of taxol) and NA (high-content of taxol) for further study. Firstly, degradome and RACE are used to identify target transcription factors of miR5298b. Then these targets are functionally analyzed to select the key transcription factors and clarify their regulation mechanisms on taxol biosynthesis. Afterwards, the regulation mechanism of miR5298b-transcription factors-taxol biosynthesis is concluded. Finally, a transgenic cell line, that both miR5298b and the key factor are genetic modified, is constructed to evaluate the industrial value on producing taxol. Our results would not only enlarge the understanding of taxol regulation system, but also provide advices for genetically engineering of Taxus cells. It is very meaningful for plant-cell technology to produce other secondary metabolites.

植物细胞培养过程中次生代谢产物产量不稳定，是制约其产业化的“瓶颈”。解析红豆杉细胞紫杉醇生物合成机制有助于提高细胞培养生产紫杉醇的产业化水平。miRNA是在转录后水平作用的调控因子，参与很多重要发育及代谢过程。我们前期研究发现一个特异性miRNA（miR5298b），其可能是通过调控多个转录因子来极显著调控紫杉醇合成。本研究拟以长期继代低产细胞系CA及新诱导高产细胞系NA为研究材料，首先利用降解组测序和RACE等技术鉴定miR5298b的靶标基因（转录因子）和途径，进而深入研究这些靶标转录因子调控紫杉醇合成机制，明确miR5298b-转录因子调控紫杉醇合成的节点和网络，最后构建miR5298b及其关键靶标基因的共表达转基因细胞系，并评价其应用潜力。研究结果不仅可以丰富紫杉醇生物合成的转录调控理论，还将为红豆杉细胞系的基因工程改良提供依据。项目的完成对于其它药用植物细胞培养有很好的指导意义。

植物细胞培养过程中次生代谢产物产量不稳定，是制约其产业化的“瓶颈”。 miRNA是在转录后水平作用的调控因子，参与很多重要的发育及代谢过程。本项目对一个特异性miRNA（miR5298b）调控抗肿瘤药物紫杉醇合成作用及机理进行了系统研究。首先基于转录组和降解组数据绘制了miR5298b介导的SA信号通路调控网络图谱，筛选出同时受miR5298b和SA调控，且与紫杉醇合成及调控相关基因协同表达的候选调控子NPR3及下游关键调控因子TGA6和WRKY33，随后揭示了这些关键节点因子的互作，主要包括：通过miR5298b超表达及干涉实验确定了miR5298b对紫杉烷类产物合成的调控作用；通过双荧光素酶实验确定miR5298b通过剪切NPR3的mRNA序列从而抑制NPR3的表达；通过酵母双杂交和Bifc实验确定NPR3与TGA6形成蛋白复合体发挥作用，并通过超表达及RNAi及产物检测确定了下游关键调控因子TGA6和WRKY33的抑制和激活功能；通过酵母单杂交和双荧光素酶实验确定TGA6对下游紫杉醇合成酶基因TS、T10H等的抑制作用以及WRKY33对下游基因DBAT、ERF15等的激活作用。通过上述研究，揭示了miR5298b调控紫杉醇合成的机理，主要包括两种，一是miR5298b通过直接降解SA信号通路中的关键信号传递蛋白NPR3的mRNA序列，减弱NPR3-TGA6蛋白复合体对下游紫杉醇合成酶基因如DBAT，TASY，2位羟化酶(T2H)，13位羟化酶(T13H)，TAT等的抑制作用；二是通过介导SA信号通路提高了下游SA信号传递因子WRKY33的表达，进而提高了如DBAT，TASY，2位羟化酶(T2H)，10位羟化酶(T10H)，DBTNBT(3'-N-debenzoyltaxol N-benzoyltransferase)等紫杉醇合成酶基因的表达。这两种调控方式均能一定程度地提高红豆杉中紫杉醇的生物合成，特别是miR5298b-NPR3-TGA-TBG（TBG：紫杉醇合成基因）通路，通过对SA信号关键传导蛋白NPR3的降解从而扰动整个SA信号传递过程，进而提高紫杉醇合成量。该研究结果不仅可以丰富紫杉醇生物合成的转录调控理论，还将为红豆杉细胞系的基因工程改良提供依据。同时,项目的完成对于其它药用植物利用细胞大规模培养稳定生产次生代谢产物有很好的指导意义。