青藏高原牦牛EPAS1和EGLN1基因低氧适应遗传机制的研究

高寒和缺氧是高原地区主要的生态限制因子，牦牛(Bos grunniens) 在长期的适应进化过程中形成了独特的高原低氧适应策略，EPAS1和EGLN1基因可能起着关键性作用。本课题拟从牦牛血液生理指标及组织代谢特征等角度入手，以当地黄牛和低海拔地区黄牛为对照，采用生物信息学与分子生物学相结合的方法，辅以蛋白质分析技术(Western Blot)，对不同海拔高度牦牛EPAS1和EGLN1基因进行克隆鉴定、对其多态位点进行检测和单倍型分析，对具有SSCP多态性的片段进行测序，找出突变位点；进而从功能因子在牦牛不同组织中的mRNA水平和蛋白表达水平进行系统深入地研究，探索牦牛通过提高血液中血红蛋白含量来适应低氧环境的独特机制。以期揭示牦牛适应高寒低氧环境的分子遗传学机制。为发掘牦牛优良种质资源、提升其对环境变化的适应能力、维系青藏高原生态系统稳定性提供理论和技术支撑。

本课题从牦牛血液生理指标及组织代谢特征入手，以不同海拔梯度牦牛(甘南牦牛、大通牦牛、天祝白牦牛、帕里牦牛)和高原地区黄牛为研究对象，利用分子生物学技术，通过研究牦牛EPAS1基因cDNA的克隆及分子特征、特异性SNPs的遗传变异及mRNA表达规律，筛选出了牦牛适应高原低氧环境的分子信标；研究主要发现：（1）在高海拔环境中，牦牛血红蛋白有所升高，但差别不明显，这说明牦牛对高海拔低氧的适应并不是从增加血红蛋白浓度上来实现的，可能是提高了血红蛋白输送氧气的能力和效率；（2）随海拔升高，牦牛血液转铁蛋白（transferrin）丰度升高，可能是其高寒低氧适应的重要遗传基础之一；（3）牦牛EPAS1基因均含有完整的编码区(CDS)序列和一个长度为2613bp的开放阅读框，编码870个氨基酸。在牦牛EPAS1基因中检测到3个特异性的SNP (g.83052 C＞T，g.83065 G＞A，g.83067 C＞A)，这3个SNP位点具有AA、AB、AC、BC、CD 5种基因型。生活在海拔3000m以上地区牦牛CD基因型频率显著高于生活在2700m牦牛(P<0.05)。通过比较帕里牦牛中各基因型个体的血常规指标，发现CD基因型个体的血红蛋白浓度显著高于其他基因型个体(P<0.05)，推测CD基因型的牦牛可能更适应高原低氧环境。（4）Real-time PCR技术对牦牛和高原地区黄牛各组织中的EPAS1基因mRNA的表达量定量分析表明，EPAS1基因mRNA在所牦牛和黄牛的各组织中均有表达，且在高原地区黄牛肺和肝中的表达量极显著高于牦牛(P<0.01)。说明黄牛在进入高原后，其适应低氧环境的生理调节主要发生在肺、肝和脾中。（5）对牦牛肝脏小RNA文库进行高通量测序后，共获得大于18nt的clean读数17,562,643条，鉴定了369个保守成熟miRNA和41个新miRNA；其中序列读书前10的miRNA占整个牦牛肝脏miRNA组学的92%（9,854,350），预测到2,333个差异表达的靶基因。预测的靶基因GO和KEGG分析表明牦牛肝脏中miRNA的miRNA的靶基因主要涉及了胰岛素信号转导通路、PI3K-Akt信号转导通路、mTOR信号通路和MAPK通路上等能量代谢、脂肪合成相关的信号通路。并高度富集到细胞转录、代谢和生物学调节等过程。