CCL20基因敲低型人角质形成细胞克隆的生长特性及分子机制研究

及时修复创面是救治大面积皮肤创伤患者的关键救治措施。采用基因技术修饰皮肤细胞获得的组织工程种子细胞和诱导多能干细胞已成为皮肤创面修复与再生的研究热点。然而，基因转移所用的逆转录病毒载体有可能改变细胞的生物学性状，其机制仍有待深入研究。本项目拟以前期研究获得的CCL20基因敲低型人角质形成细胞克隆为对象，从细胞的多种生长性状改变着手进行观察和初步分类，筛选出不同生长特性的CCL20基因敲低型细胞克隆。在此基础上采用基因芯片技术和蛋白质组学研究技术检测不同生长特性细胞克隆的基因和蛋白质表达谱系，并结合其慢病毒载体的整合位点倾向进行综合分析，在分子水平上阐明细胞克隆生长特性异常的发生机制。本研究将深入分析慢病毒载体在表皮细胞基因组中整合位点分布的规律，为筛选安全、有效的组织工程皮肤种子细胞进行皮肤创面修复提供重要的实验依据，并对低遗传毒性的慢病毒载体的改良和设计具有重要的参考价值。

本项目根据11株CCL20基因敲低型人角质形成细胞克隆的体外生长曲线结果可将这些克隆分成四类：（1）与HaCaT细胞类似的克隆6F-2、7A-2；（2）比HaCaT细胞生长较快的克隆仅有10F-2；（3）比HaCaT细胞生长较慢的克隆4E-2、1E-2、1A-2和8H-2；（4）比HaCaT细胞生长更慢的克隆3F-2、8B-1和3B-1。这四类克隆的代表6F-2、10F-2、4E-2和3F-2均伴有不同程度的细胞周期、细胞凋亡、表皮干细胞表型以及胚胎干细胞表型mRNA和蛋白表达水平变化。慢病毒载体倾向于整合在人角质形成细胞克隆中的第16、20号染色体上；而不倾向于整合在其第4、5号染色体上。慢病毒载体在6F-2和3F-2克隆基因组中的整合位点倾向性均同时兼有慢病毒属及γ逆转录病毒属的特点， 而在10F-2和4E-2克隆基因组中的整合位点倾向性均与γ逆转录病毒属的特点相似。在人角质形成细胞克隆10F-2、6F-2、4E-2和3F-2基因组中共发现874个慢病毒载体整合位点，其中435个位点整合在基因内。仅在6F-2、4E-2和3F-2克隆基因组中发现13个位点整合在癌基因内，其中癌基因FANCC、GRAF、MYH9和LPP内各有2个整合位点。4株代表性克隆的基因表达谱发生了广泛改变，表明病毒DNA的插入对细胞基因组的表达有着广泛的影响。这种差异在四株转染株细胞中都体现为mRNA表达的下调多于mRNA表达的上调，非编码RNA的转录本含量则上调多于下调。这很可能是细胞对慢病毒转染后错误转录的一种自我修复性质的转录后修饰机制。同时四株细胞在通路富集方面都高度富集于丝裂原活化蛋白激酶通路，提示慢病毒载体转染对宿主细胞的基因影响具有一定的倾向性。而丝裂原活化蛋白激酶通路的改变也很可能是造成转染株细胞生长特性改变的原因。蛋白组的改变总体上较基因表达谱的改变明显要小，表明转录后修饰和翻译后修饰作用的存在能够有效防止基因表达谱层面剧烈的改变体现在蛋白谱层面，对维持细胞表型稳定具有重要意义。差异表达谱和蛋白谱之间存在着一定程度上的关联。两者间关联的基因在mRNA和蛋白含量上也存在着一定的相关性。但差异表达谱、蛋白谱和基因内整合位点三者之间共同的关联性不大。这提示这种关联上的割裂现象很可能来自于生物信息学分析技术的限制。