dio3b基因敲除对斑马鱼神经系统发育的影响及分子机制研究

Thyroid hormone plays an important role in neural development of fetus during early stages of pregnancy, however, due to lack of appropriate animal models, the mechanism by which thyroid hormone involved in the development of neural system is still unclear. We use zebrafish dio3b gene knock-out model established by Cas9 system to elucidate this question. Our main research contents are as follows: First, through the analysis of thyroid hormone target genes expression pattern in the brain tissues, illustrate knockout of dio3b leads to hyperthyroidism of brain tissue at different time; Second, we further assess the morphology of brain, learning ability and mobolity of the fish; Third, histopathologic analysis of different parts of brain and detection of expression of molecular markers of neurons will be performed to illustrate dio3b knock-out leads to damage of certain brain regions or specific cell types. Our previous data show that enhanced apoptosis was found in the brain of fish injected with dio3b morpholinos after 24 hours postfertilization. Further study will focus on cell apoptosis, proliferation and differentiation. Potential molecular signaling pathway will be detected to clarify the mechanism of dio3b knock-out result in abnormal neural develpoment. This project outlines that hyperthyroidism of the fetus during early stages of pregnancy has impact on the development of brain and will clarify the possible molecular mechanisms. This project will provide theoretical basis for processing hyperthyroidism of fetus during early pregnancy.

在孕早期甲状腺激素对胎儿神经系统发育具有重要影响，目前由于没有合适的动物模型，其分子机制尚不明确。本项目拟建立斑马鱼dio3b基因Cas9敲除模型，模拟孕早期胎儿脑组织甲状腺功能亢进（甲亢），研究发育早期脑组织甲亢对神经系统发育的影响及其分子机制。主要研究内容包括：1.通过对甲状腺激素在脑组织靶基因的表达分析，明确dio3b的敲除是否导致脑组织甲亢；2.在Cas9敲除的斑马鱼模型中观察其对脑形态发育、学习和运动能力的影响；3.通过组织病理及不同脑区神经元分子标志的原位杂交，明确dio3b敲除导致发育受损的脑区和细胞类型；4.分析dio3b敲除对脑组织细胞凋亡、增殖、分化的影响，明确dio3b敲除导致神经发育异常的分子机制。本项目将加深人们对孕早期甲状腺功能亢进对胎儿神经系统发育的影响及其分子机制的理解，并为孕早期甲亢的处理提供理论依据。

甲状腺激素对胎儿神经系统发育有重要作用，母体怀孕期间，因缺碘造成胎儿碘摄入不足，从而使甲状腺激素合成减少，严重影响胎儿中枢神经系统发育。但在胚胎发育过程中，甲状腺激素如何在细胞、分子水平上参与神经系统发育，人们所知甚少。我们课题组利用斑马鱼为模型研究甲状腺激素对胚胎神经系统发育的影响，可避免母体和胎盘中的甲状腺激素的影响。甲状腺激素水平主要受脱碘酶1,2,3调控，脱碘酶3(Dio3)在斑马鱼中有两种同源蛋白，分别是Dio3a, Dio3b，其中Dio3b是斑马鱼中失活甲状腺激素最主要的酶。我们早期利用Morpholino敲低斑马鱼Dio3b的表达，发现Dio3b敲低后胚胎发育迟缓，早期脑细胞大量死亡，胚胎期斑马鱼体长变短，并且这一表型可以被甲状腺激素受体拮抗剂部分逆转，说明该表型由甲状腺激素受体信号通路异常导致。考虑到Morpholino敲低基因的作用只能维持3天，甲状腺激素对不同阶段脑组织发育的影响需要进一步研究。因此，本项目希望构建dio3b永久性敲除的斑马鱼模型，在该模型中研究甲状腺激素影响神经系统发育的作用机制。本项目取得以下进展：1. 通过原位杂交鉴定斑马鱼发育不同阶段Dio3b的表达谱，发现Dio3b主要表达在斑马鱼后脑部位。2. 通过检测Dio3b在斑马鱼发育不同阶段的酶活性，我们发现Dio3b在72hpf活性最强。3. 利用CRISPR-Cas9构建Dio3b基因敲除的斑马鱼家系，发现Dio3b敲除后，成年斑马鱼心率升高，自主运动增强，与临床甲亢表型类似，从功能上证明利用Dio3b敲除的斑马鱼模型研究甲状腺激素功能的可行性。4. Dio3b基因敲除后，早期神经祖细胞，前体细胞增多，后期逐渐恢复正常，证实甲状腺激素在早期发育过程中影响神经细胞功能。本项目利用CRISPR-Cas9构建Dio3b敲除斑马鱼模型，模拟临床甲亢表型，并证实甲状腺激素在发育早期对斑马鱼神经系统的影响。.本项目部分结果发表在《中华内分泌》刊物上，在该项目的部分基金资助下，SCI论文1篇修回中，培养硕士研究生2名，博士研究生3名。