基于细胞骨架蛋白研究大豆凝集素引发仔猪小肠上皮细胞凋亡的机制

Soybean agglutinin (SBA) is an anti-nutritional molecule located in soybean and soybean products. Such molecule can bind to the surface of intestinal epithelial cells and induce anti-nutritional effects. Cytoskeletons are the main SBA-binding proteins on IPEC-J2 cell membranes. The cytoskeleton plays a major role in maintaining cell morphology and regulating cell biological functions. There is a close relationship between the cytoskeleton proteins and both the internal and external apoptotic pathways. In the herein research, intestinal epithelial cell from piglets (IPEC-J2) was selected as an in vitro cell model and some representative cytoskeleton proteins such as cytokeratin 8, cytokeratin 18 and actin, were used to detect apoptosis pathway. The objectives of the herein research is to explore the roles of these three cytoskeleton proteins in SBA-induced cell apoptosis of IPEC-J2; to detect the roles of these cytoskeletons on the structural and functional modulation in mitochondria, mitochondrial pathway, endoplasmic reticulum stress pathway, death receptor pathway, and crosstalk between these three pathways induced by SBA; and to reveal the roles of these cytoskeleton proteins in different SBA-induced apoptotic mechanisms and signal pathways. This research further elucidated the molecular mechanisms of SBA induced apoptosis, and further revealed the anti-nutritional mechanism of SBA on a more deeply level.

大豆凝集素（SBA）是存在于大豆及大豆产品中的抗营养物质，通过与肠道上皮细胞的特异性结合，产生抗营养作用。分布在仔猪小肠上皮细胞（IPEC-J2）膜上的SBA特异性结合蛋白主要为骨架蛋白。细胞骨架蛋白在维持细胞形态及调节细胞生物学功能中发挥着主要的作用，且细胞骨架蛋白与细胞凋亡通路中的内部途径和外部途径之间存在密切关系。据此，本研究以IPEC-J2为细胞模型，选取SBA特异性结合的骨架蛋白中对细胞凋亡作用较为显著且具有代表性的角蛋白8、角蛋白18以及肌动蛋白为研究对象，探明这三种细胞骨架蛋白在SBA引起IPEC-J2细胞凋亡中的作用；探讨这些骨架蛋白在SBA影响线粒体结构和功能、细胞凋亡的线粒体、内质网应激和死亡受体通路以及各通路之间串扰中的作用，揭示细胞骨架蛋白在SBA引起不同细胞凋亡途径中的作用。本研究进一步阐明SBA引起细胞凋亡的分子机制，从更深层次上揭示SBA的抗营养机制。

大豆凝集素（SBA）是大豆及大豆产品含有的抗营养物质，会通过与肠道上皮细胞膜蛋白特异性结合，进而影响肠上皮细胞的代谢过程。本研究以仔猪小肠上皮细胞系（IPEC-J2）为细胞模型，选取SBA特异性结合的骨架蛋白中对细胞凋亡作用较为显著的角蛋白8（KRT8），角蛋白18（KRT18）和肌动蛋白（ACTA）为研究对象，探明这三种细胞骨架蛋白在SBA引起IPEC-J2细胞周期、凋亡以及不同细胞凋亡信号转导路径中的作用。实验结果发现，SBA可阻滞IPEC-J2细胞周期于G0/G1期，引起细胞凋亡。SBA显著降低KRT8，KRT18和ACTA的基因以及蛋白表达量。抑制细胞骨架蛋白基因表达会引起细胞周期阻滞，促进细胞凋亡，三种细胞骨架蛋白对细胞周期和凋亡的影响程度存在差异，作用强度依次为ACTA＞KRT8＞KRT18。KRT8，KRT18和ACTA在SBA诱导的IPEC-J2细胞周期和凋亡改变中发挥中不可或缺的作用，SBA会通过降低细胞骨架蛋白的表达量，进而引起细胞周期阻滞，促进细胞凋亡，并且这三种骨架蛋白在SBA引起细胞周期和凋亡的改变过程中有一定的累加作用。SBA引起IPEC-J2细胞凋亡的信号转导路径主要涉及线粒体、内质网应激和死亡受体介导的细胞凋亡路径：即SBA会引起线粒体裂变体蛋白（Fis1）和融合蛋白（Mfn2）的上调，改变线粒体网络结构，损害线粒体功能，降低ATP的合成，促使线粒体内Cytc和AIF进入到细胞质内，激活Caspase-9和Caspase-3，激活线粒体介导的细胞凋亡路径；SBA可上调细胞GRP78、XBP-1、eIF2α、CHOP蛋白的表达水平，下调ASK蛋白的表达水平，激活内质网应激介导细胞凋亡路径；SBA还会引起细胞FADD蛋白由细胞质向细胞膜上移位，同时增加胞中FasL表达量，增加Casapse-8活性，激活细胞死亡受体介导的细胞凋亡路径；SBA可上调细胞总蛋白中Bax蛋白的表达水平，下调总蛋白Bcl-2和胞质中Bid的表达水平，引发细胞内质网与线粒体之间、以及死亡受体途径与线粒体途径之间的串扰。而SBA对IPEC-J2细胞以上三个细胞凋亡路径的影响主要是通过降低KRT8、KRT18和ACTA表达量而引起的。本研究从细胞生物学和分子生物学角度进一步阐明SBA引起细胞凋亡的分子机制及信号通路，从更深层次上揭示SBA的抗营养机制。