SIX6OS1纯合无义突变导致精母细胞同源染色体联会延伸失败

In human, spermatocyte development arrest (SDA) can result in azoospermia. However, little is known about the molecular basis and mechanism of SDA. Using whole exome sequencing and bioinformatic approaches, we detected a homozygous nonsense mutation of SIX6OS1 (c.958G>T) in a SDA patient. We generated mice with the same mutation. Preliminary studies showed that homozygous mutant mice are infertile due to the spermatogenesis arrest at primary spermatocyte stage. Furthermore, the synapsis can start, but cannot expand to the whole chromosome. Based on these results, we hypothesize that this nonsense mutation in SIX6OS1 may lead to the failure of homologous chromosome synapsis expansion, which consequently results in azoospermia. In this project, we will exclusively study the impact of this mutation on synapsis and will also investigate the detail molecular mechanisms of the defects in synapsis expansion caused by this mutation. Based on these studies, we will confirm that SIX6OS1 is indispensable for the synapsis expansion, and the results will provide a new insights into the novel mechanism of synaptonemal complex formation.

人精母细胞发育停滞将导致无精子症，但对其分子基础和机制，仍了解甚少。我们用全外显子测序和生物信息学分析在精母细胞发育停滞患者中，发现了SIX6OS1纯合无义突变（c.958G>T），并制备了携带该突变的小鼠。初步研究发现纯合突变雄鼠不育，精子发生停滞于初级精母细胞阶段，而且同源染色体联会可以起始，但不能贯穿染色体全长。因此我们推测：SIX6OS1纯合无义突变导致同源染色体联会延伸失败，最终诱发无精子症。为此，拟开展以下工作：1）深入研究该突变对同源染色体联会的确切影响；2）探讨其导致联会延伸失败的机制。以期证实SIX6OS1是联会延伸所必需，为联会复合体的形成提供新解释和新机制。

减数分裂是包括人类在内的所有有性生殖生物的基本特征，也是精子发生的必经途径。其中任何一步出现异常，都会引起精母细胞发育停滞，最终导致精子无法形成，在临床上表现为无精子症。在减数分裂中，同源染色体会发生配对、联会和重组等一系列事件，而这些染色体行为与联会复合体(SC)的形成和解聚密切相关。我们通过对人类无精子症患者进行细致地分析分类，对其中精母细胞发育停滞的无精子症进行了全外显子组测序，发现了SIX6OS1纯合无义突变（SIX6OS1c.958G>T/c.958G>T）。SIX6OS1又叫C14orf39，在小鼠中的同源基因是Six6os1，是SC中轴成分之一。SIX6OS1从偶线期开始定位于同源染色体的联会区域，到粗线期贯穿整个染色体轴。通过Sanger测序分别在基因组和mRNA水平证实了该突变的存在，同时对患者睾丸组织切片进行免疫荧光染色发现该突变会导致截短蛋白产生（p.G319X）。为了确定该突变是否导致患者不育，我们利用CRISPR/Cas9技术制备了携带患者类似突变的小鼠模型Six6os1ΔC/ΔC。Six6os1ΔC/ΔC小鼠睾丸明显减小，组织学分析显示没有减数分裂后的细胞，接着，通过减数分裂进程分析发现其精母细胞发育停滞在类粗线期。此外，Six6os1ΔC/ΔC小鼠减数分裂程序性DSBs的产生正常，但是同源重组不能完成，无法形成交叉。进一步，我们发现在Six6os1ΔC/ΔC小鼠的精母细胞中存在不连续的横向纤维SYCP1信号，同时也存在中轴成分SYCE1信号，说明同源染色体可以起始联会但不能完全联会。我们还通过酵母双杂交发现SIX6OS1 N端可以与SYCE1结合，其C端可以介导自身的二聚化。综上所述，我们从男性不育患者入手，发现并证明了C14orf39的基因突变会导致人类不育，同时发现C14ORF39/SIX6OS1对于减数分裂同源染色体之间联会复合体的起始组装和延伸都是必需的，为联会复合体的形成提供新解释和新机制。在项目执行过程中，我们按期撰写年度进展报告，并整理相应研究进展以论文形式予以发表。在项目资助下发表SCI论文13篇，申请专利1项，参与安徽省科技进步奖1项；通过项目实施，参与培养博士研究生3名，并让参与项目的人员得到了锻炼。