RNA剪接因子SF1纯合移码突变导致人和小鼠精子发生异常

Azoospermia, defined as no sperm in semen for at least two examinations, is reported in up to 10-20% of infertile men. The molecular basis and mechanism need to be elucidated. Previously, we found a homologous frameshift mutation of splicing factor SF1 gene in a specific transcript in azoospermia patients from a Pakistani consanguineous family and the some region mutation in mice results in male infertility and spermatogenic abnormalities. In this project, we will analyze the phenotype of SF1 knockout and knockin mice to find out which stage of spermatogenesis is affected, then we will study SF1’s role on mRNA splicing to identify SF1 regulated mRNAs, finally we will try to determine the expression and localization of SF1 and its target proteins in SF1 mutated testicular tissue. Our work will confirm that mutation in SF1 can cause azoospermia in human and reveal its pathogenic mechanism, providing molecular markers for genetic diagnosis of azoospermia patients and in early embryos derived from assisted reproductive technology.

无精子症是至少两次精液检查均未发现精子，约占男性不育的10-20%。但对人无精子症的分子基础和机制，仍了解甚少。我们用全外显子测序和生物信息学分析的方法在巴基斯坦近亲婚配家系的无精子症患者中发现剪接因子SF1特异转录本的纯合移码突变，并制备了相应突变小鼠，发现移码突变产生的敲除小鼠不育且精子发生异常。为阐明SF1突变如何导致人和小鼠精子发生异常，拟开展以下工作：首先，分析SF1敲除和突变敲入小鼠表型，确定突变影响的精子发生阶段；进而研究SF1突变对剪接的影响，鉴别SF1调控的靶基因；最后，用SF1突变携带者睾丸组织切片对SF1及靶基因的表达和定位进行分析。以期发现并证实SF1纯合移码突变导致人类无精子症，揭示突变致病机理，为相关无精子症患者基因诊断和人工辅助生殖胚胎遗传诊断提供分子标志。

为了研究人无精子症的分子基础和机制，我们按照申请书的计划开展了相应的计划：我们在巴基斯坦发现了一个不育家庭，该家族的许多男性成员不育且是无精子症，进而利用外显子测序平台对收集到的部分家系成员的外周血DNA进行了全外显子测序，在无精子症患者IV:1中，其剪接因子SF1基因有一个A插入到了其特殊转录本（uc010rno.2）第202位碱基上，从蛋白质水平上来看，该基因的第68位氨基酸由苏氨酸（Thr，T）突变成谷氨酰胺（Asn，N）并造成移码突变，并且提前在第73个氨基酸的位点产生了终止的信号。进而运用CRISPR/Cas9技术在与人SF1突变位点同源的区域的小鼠的Sf1基因进行基因敲除，获得纯合缺失了10个核苷酸的敲除小鼠，且敲除小鼠不育。进一步研究敲除小鼠不育的原因，发现敲除小鼠的睾丸在形态上明显偏小，敲除小鼠的睾丸中的精子发生存在着明显的异常，例如存在空泡和生殖细胞发育停滞等，另外，敲除小鼠的附睾中的精子存在情况也存在着异常，即附睾中基本上没有成熟的精子。此外，在项目执行过程中，按期撰写年度进展报告，并发表研究论文1篇。