铁蛋白介导的化脓链球菌铁转运分子机制

Iron is an essential element for the survival and infection of almost all bacteria. However, iron in excess is toxic. Bacteria uptake iron and keep intracellular iron in homeostasis. Understanding the iron transport mechanism in bacteria may provide noval clues for efficient inhibition of pathogenic infections by bacteria.. Based on our solid research background, this proposal aims to comprehensively study the iron-uptake systems in Streptococcus by using bioinorganic, biophysical, biochemical and molecular biology methods. We will compare the metal-binding properties of the important proteins in three known iron transport systems, uncover their structure-function relationship and elucidate their roles in iron uptake. In addition, we will use metalloproteomic approaches to screen for additional potential iron transport proteins; use cellular and molecular methods to confirm the functions of key proteins and to investigate their upstream and downstream relationship, and thus to reveal the iron transport pathways and molecular mechanism in Streptococcus. We believe that the results derived from this project will provide the theoretical basis for the development of new vaccines and anti-bacterial drugs targeting on the iron transport proteins.

铁是绝大多数细菌生存和形成感染的必需元素，而过量的铁则具有毒性，细菌依靠铁蛋白介导的铁转运和调节系统来获取铁元素并维持细胞内的铁处于平衡态。明确细菌的铁转运机制可以为找出抑制相关病原菌感染的方法提供新思路。.本课题组拟在前期工作的基础上，综合利用无机化学、生物物理、生物化学和分子生物学的方法全面研究链球菌的摄铁系统。深入比较研究链球菌中已知的三种铁转运系统中重要蛋白的金属结合特性，了解其结构与功能的关系，明确其在细菌铁摄取中所起作用；并运用金属蛋白质组学方法筛选其他与铁转运相关的金属蛋白，探索可能存在的新的转铁途径；用细胞分子生物学手段确证关键蛋白分子，构建铁转运的蛋白质上下游关系，揭示链球菌铁转运通路及其在宿主中适应性生长的分子机制；为开发基于转铁蛋白为特异性靶标的疫苗和抗菌剂提供理论基础。

肺炎链球菌是一种革兰氏阳性菌，会引起肺炎、脑膜炎等一系列疾病，对人类（特别是儿童、老人、免疫缺陷患者）健康造成重大威胁。铁是绝大多数细菌生存和感染所必需的元素，所以细菌进化出了对铁离子具有高度亲和力的铁ABC摄取系统，目前对于肺炎链球菌的铁离子转运机制还所知甚少。.本项目首先通过体外表征深入比较研究了肺炎链球菌中已知转铁系统中的脂蛋白PiaA和PiuA的金属结合特性，了解其结构与功能的关系，明确PiaA与血红素转运相关，而PiuA是与铁色素转运相关。同时体内实验表明，与PiuA蛋白相比，PiaA蛋白是一个更重要的转铁脂蛋白。.同时，为发现新的转铁蛋白，我们通过采用基因敲除技术构建了缺失已知转铁基因piaA/piuA/pitA的三突变株。我们运用差异蛋白质组学和翻译组学相结合的方法来筛选与铁摄取和转运相关的未知蛋白质。共鉴定到84个DEPs和DEGs变化趋势一致（包括62个DEPs和DEGs在piaA-/piuA-/pitA-三突变株中上调），通过同源比对和生物信息学等整合分析，我们选取了在三突变株中高表达的SPD_0090和SPD_1609两个膜蛋白作为新的铁转运候选蛋白，并用Western blot进一步验证这两个蛋白在三突变株中表达量确实升高。.我们对这两个蛋白的体内生物学功能和体外金属结合特性进行全面的研究，明确了SPD_0090和SPD_1609是新的转铁相关的蛋白。体内方面，我们分别构建了0090-和1609-突变株，进行相关的生物学功能研究，结果表明SPD_0090和SPD_1609参与了铁转运。体外方面，我们纯化表达了SPD_0090蛋白，并运用ICP-MS、紫外光谱、荧光光谱、停留仪等表征手段，证明了0090蛋白与Hemin结合。以上实验结果进一步拓展了我们对链球菌属铁转运机制的理解。.最后，我们针对细菌的转铁机理设计和合成化学药物Ru(II) complex R-825，通过一系列实验证实了R-825可以通过铁色素摄取系统 PiuABCD进入肺炎链球菌体内，R-825通过与铁色素竞争铁结合位点从而降低细菌的铁获取，因而抑制了细菌的生长。由于细菌摄铁机理与人类完全不同，而铁色素摄取系统广泛分布于各种细菌体内，所以依据细菌铁色素摄取系统设计的R-825及其衍生物不会干扰人体的转铁系统，可能代表着一类新型的抗菌试剂。本研究为抗菌药物的开发提供了新的视角。