猪链球菌铁吸收与调控分子遗传分析

铁为生命活动所必需，病原菌与宿主之间对铁元素的争夺被认为是感染发生与发展的核心。猪链球菌获铁机理目前还不清楚。生物信息分析和我们近期研究结果表明，该菌存在4个与铁吸收相关操纵子。RT-PCR检测显示，菌株在铁限量和过量培养条件下，铁吸收相关关键基因表达存在差异，部分差异与金属依赖调节蛋白mtsR基因缺失相同。小鼠感染模型证实，mtsR缺失株毒力下降。结合化脓性链球菌MtsR调控铁的吸收和毒力基因表达，与链球菌重症感染有关，我们推断猪链球菌MtsR也具有类似功能。为此，本课题拟在前期研究基础上，采用基因敲除、基因表达分析、实时定量RT-PCR、双向凝胶电泳、质谱分析、凝胶电泳迁移率改变分析和染色质免疫沉淀等技术与方法，调查猪链球菌铁吸收途径，分析MtsR对细菌铁的吸收与毒力因子表达调控分子机理。研究结果不仅有助加深对猪链球菌致病和毒力调控机制了解，还有望发现新的药物筛选靶点和疫苗候选分子。

铁为生命活动所必需，病原菌与宿主之间对铁元素的争夺被认为是感染性疾病发生与发展的核心。正常情况下，宿主体内存在的高铁结合常数和低饱和度（30～40％）的铁结合蛋白，使体内环境中可利用铁的几乎为零，确保了机体自身免疫系统应对病原菌的反复攻击。病原菌为了从宿主体内获得自身可利用的铁，进化形成各种非常有效的铁吸收转运系统，从机体中夺取铁，以满足生长繁殖和感染的需要，通过调控蛋白精确调节铁的吸收，使体内铁离子浓度始终保持平衡。猪链球菌2型（Streptococcus suis type2, SS2）中国分离菌株如何获得金属元素铁及其调控机理目前还不十分清楚。生物信息分析显示，SS2中国分离株05ZYH33基因组存在编码4个与铁吸收相关的操纵子基因以及金属吸收调节基因fur和金属依赖转录调节基因mtsR。本项目用专一性铁螯合剂Dipyridyl螯合培养基中的铁，研究铁元素对SS2临床分离株生长繁殖的影响，确定铁元素为SS2中国分离菌株生长繁殖所必需。用温度敏感载体系统，通过基因敲除方法构建猪链球菌mtsR基因缺失突变株，采用定量RT-PCR方法，检测mtsR缺失突变株金属元素吸收操纵子的金属绑定基因和目前报道的猪链球菌8个主要毒力因子表达，结果显示mtsR缺失上调Mts操纵子金属绑定蛋白mtsA基因和毒力因子mrp、gdh、hly基因的表达，而对Feo操纵子的feoA基因和毒力因子epf，cps，sly和orf2基因表达来说，mtsR缺失株基因表达下调；小鼠感染模型证实，mtsR基因缺失突变株毒力下降，进一步证实MtsR与SS2毒力相关。通过极性突变方法，构建mtsA基因缺失极性突变株，确定Mts操纵子由mtsA，mtsB，mtsC和mtsD 结构基因组成。mtsA基因缺失影响菌株对金属元素铁的吸收；用pET32质粒构建MtsA表达载体，分离纯化后的重组蛋白MtsA，能与宿主血红蛋白结合，首次发现SS2中国分离菌株Mts操纵子参与无机铁元素和宿主血红蛋白铁的吸收。. 本课题研究结果确认了铁元素为SS2菌株生长繁殖所必需；证实猪链球菌MtsR蛋白调控铁的吸收和毒力基因表达，MtsR蛋白与菌株的致病性相关。确定猪链球菌Mts操纵子具有无机铁和宿主血红蛋白铁吸收转运功能，研究结果为进一步研究猪链球菌铁吸收与毒力因子表达调控分子机理奠定了坚实的基础。