MICU1调控的MCU摄入线粒体钙离子途径在癫痫神经损伤中的作用及机制

Seizure-induced mitochondrial calcium overload makes epileptic neurons more sensitive to injury. Recent studies have identified mitochondrial Ca2+ uniporter (MCU) and its regulator of mitochondrial Ca2+ uptake 1 (MICU1) play important roles in the mitochondrial Ca2+ uptake. However, the function and mechanism of MICU1 regulated MCU-mediated mitochondrial Ca2+ uptake in seizure-induced neuronal injury is still unknown. Our previous study found that there existed mitochondrial Ca2+ overload and the expression of MICU1 was significantly decreased in primary cultured hippocampal neuron epileptic discharge. So we speculate the disruption of mitochondrial Ca2+ homeostasis induced by disruption in the balance between MICU1 and MCU may affect the development of epilepsy. Using in vitro primary cultured hippocampal neuron epileptic discharge and in vivo pilocarpine-induced rat model of temporal lobe epilepsy，we will confirm the interaction of MCU and MICU1 by GST pulldown and co-immunoprecipitation and detect the effect of MCU and MICU1 on apoptosis, mitochondrial calcium concentration, mitochondrial movement and injury by molecular biology and Laser scanning confocal technology microscope by constructing lentiviral vectors to regulate the expression of MCU and MICU1. In addition, we will further explore the mechanism of MICU1 regulation of MCU-dependent Ca2+ uptake by regulation of MCU（Spermine or Ru360）and mPTP（CsA）. Taken together, this study will provide new theoretical basis and targets for treatment of epilepsy.

癫痫发作后线粒体钙超载介导的细胞损伤导致神经元对痫性损伤更敏感。最近研究发现线粒体钙离子单向运输体（MCU）及其调节因子线粒体钙离子感受器（MICU1）在线粒体钙离子摄入方面发挥重要作用，但其在癫痫神经损伤中的作用仍然未知。我们前期发现癫痫海马神经元存在线粒体钙超载且MICU1表达明显降低，因此推测MICU1和MCU平衡破坏引起的线粒体钙稳态失调影响癫痫的发生发展。我们拟利用体外培养海马神经元癫痫放电及PILO诱导大鼠癫痫模型，采用GST pulldown和免疫沉淀验证MCU和MICU1相互作用，并构建慢病毒载体干预MCU和MICU1表达，采用分子生物学、激光共聚焦等技术观察对细胞凋亡、线粒体钙浓度、线粒体运动及损伤等影响。再给予调控MCU（Spermine或Ru360）和mPTP变化（CsA），探讨MICU1调控MCU摄入钙离子的作用机制。本研究将为癫痫治疗提供新的理论基础和作用靶点。

最近研究发现线粒体钙离子单向转运体（MCU）在线粒体钙离子摄入发挥重要作用，但其在癫痫神经损伤中的作用仍然未知。本研究利用颞叶内侧癫痫手术标本、体外培养海马神经元癫痫放电及PILO诱导的大鼠颞叶癫痫模型，采用MCU激动剂精胺（Spermine）与抑制剂Ru360及构建慢病毒载体干预MCU表达，采用分子生物学、激光共聚焦等观察对线粒体钙离子浓度、线粒体功能、内质网应激和细胞凋亡等影响，深入探讨MCU在癫痫神经损伤中的作用机制。课题进展顺利，相关成果已以第一或通讯作者发表SCI文章5篇（最高影响因子8.689），中文核心文章8篇。研究结果如下：.1. 收集45例行癫痫外科治疗的难治性颞叶内侧癫痫患者及10例非颅脑外伤致死尸检者的颞叶内侧组织标本，发现：.（1）颞叶内侧癫痫患者术后癫痫灶组与灶周组及尸检对照组相比，致痫灶线粒体钙超载、线粒体膜电位降低及细胞死亡增多；.（2）癫痫灶组MCU蛋白和mRNA水平显著增高；灶周组与尸检对照组相比MCU蛋白和mRNA水平无明显变化。.2. 在PILO诱导急性癫痫大鼠模型中，发现海马神经元MCU蛋白和mRNA水平显著增高，应用MCU激动剂精胺（Spermine）与抑制剂Ru360干预：.（1）与对照组相比，PILO诱导的癫痫大鼠海马线粒体钙浓度显著增加，Ru360可通过缓解线粒体钙超载及氧化应激，显著减少海马神经元凋亡，而精胺则加重线粒体钙超载，显著增加海马神经元凋亡。.（2）Ru360可通过抑制细胞色素C释放、增加抗凋亡蛋白Bcl-2表达及降低促凋亡蛋白Bax表达而发挥抗凋亡作用，并且其保护作用呈剂量依赖性。.3. 在无镁诱导海马神经元癫痫模型中，构建慢病毒载体干预MCU表达后发现：.（1）抑制MCU可通过缓解线粒体钙超载、氧化应激及内质网应激对癫痫海马神经元发挥保护作用，而激活MCU发挥相反作用。采用线粒体特异性抗氧化剂Mito-TEMPO干预缓解了内质网应激及细胞凋亡，表明线粒体氧化应激介导的内质网应激可能在MCU参与癫痫神经损伤中发挥重要作用。.综上所述，本课题深入研究了MCU调控的线粒体钙离子摄入在癫痫神经损伤中的作用机制，为癫痫治疗提供了新靶点。