NLRP3炎症小体在无烟气烟草致肝损伤中作用机制研究

The use of smokeless tobacco is higher following ban passing on smoking in public places. Nicotine, easily absorbed from smokeless tobacco is metabolized primarily by the liver and can cause liver injury, which closely linked to inflammation.Our previous study showed that smokeless tobacco could induce a drop of mitochondrial membrane potential and increase cell apoptosis in HepG2 cells indicating that smokeless tobacco caused damage to liver mitochondrial. Smokeless tobacco also induced IL-1βexpression in dose-dependent manner in HepG2 cells and we know that NLRP3 inflammasome plays a key role in activation and secretion of IL-1β,so we think that NLRP3 inflammasome may be involved in liver damage induce by smokeless tobacco. Animal experiments showed that the level of AST and ALT were significantly elevated by smokeless tobacco, and pathological tissue slice appeared edema inflammatory, which further confirmed that smokeless tobacco caused liver damage. Based on previous study, we assume that smokeless tobacco could induce liver injury through the damage of liver mitochondria activated by NLRP3 inflammasome，which will be further confirmed in following experiments in vitro and in vivo and will clarify the effect of NLRP3 inflammasome in liver injury induced by smokeless tobacco.

随着公共场所禁烟令的颁布和实施，无烟烟草的使用逐渐普遍，口含无烟烟草后，尼古丁等有害物质主要通过肝脏代谢，长期服用将造成肝损伤。肝损伤的出现与炎症反应有密切关系，其中NLRP3炎症小体对IL-1β、IL-18等促炎细胞因子的激活和分泌起着关键作用。我们的前期研究发现：无烟烟草引起HepG2细胞线粒体膜电位降低和细胞凋亡，提示其对肝线粒体造成了损伤，且IL-1β表达变化与无烟烟草剂量呈正相关，提示促炎细胞因子IL-1β很可能参与了损伤过程；动物实验表明，无烟烟草引起血液ALT和AST水平显著升高，肝脏病理组织呈现水肿等炎症变化，提示其对肝脏造成了损伤。因此，我们推测无烟烟草可能通过损伤肝线粒体，激活NLRP3炎症小体进而引起肝损伤。我们拟在前期研究基础上，通过体外实验和NLRP3炎症小体基因敲除小鼠等体内实验，阐明NLRP3炎症小体在无烟烟草致肝损伤中的作用机制。

研究背景.吸烟有害健康，公共场所禁烟将导致无烟气烟草制品的使用日趋普遍，对无烟气烟草使用的安全性进行全面评估过程中发现，无烟气烟草对人体肝脏的危害性不可低估，且肝损伤的出现与炎症反应有着十分密切的关系， 炎症小体在多种肝脏炎症性疾病中起着关键作用。.主要研究内容.1、AEST对肝损伤作用研究.(1)体外细胞研究：不同剂量AEST作用于Hepa 1-6细胞后，检测各组细胞的损伤情况和凋亡率表达水平的变化。.(2)体内试验研究：不同剂量AEST连续经口灌胃雄性C57BL/6小鼠30天后，检测各组动物的血清ALT和AST、以及血清中炎症细胞因子IL-1β、IL-6、IL-12、IL-18、TNF-α的表达水平的变化，并观察肝组织的病理学变化。.2、NLRP3炎症小体在AEST致肝损伤中的作用机制研究.(1)体外细胞研究：AEST作用于Hepa 1-6细胞后，检测细胞损伤情况、凋亡率和ROS表达水平、NLRP3炎症小体相关蛋白表达水平；观测NLRP3抑制剂Gly联合AEST作用于Hepa 1-6细胞以及ROS抑制剂APDC联合AEST作用于Hepa 1-6细胞后后，上述检测指标的表达水平的变化。. (2)体内试验研究：利用（Nlrp3-/-小鼠），以C57BL/6小鼠为野生型对照小鼠。AEST连续经口灌胃后，检测各组动物血清ALT、AST表达水平的变化，观察肝组织的病理学变化，检测NLRP3炎症小体相关的基因以及蛋白表达水平的变化。.研究结果.1、无烟气烟草水提取物（AEST）可引起小鼠肝损伤.2、AEST可激活NLRP3炎症小体.AEST在体内和体外试验中均可激活NLRP3炎症小体.3、NLRP3抑制剂Glybenclamide或Nlrp3基因敲除可减轻AEST导致的肝损伤.体内和体外试验均表明上述结果.4、AEST可通过产生ROS激活肝细胞NLRP3炎症小体.与对照组相比较，400 μg/mL剂量的AEST可引起Hepa 1-6细胞ROS表达水平显著上升，Nlrp3和pro-IL-1β基因表达水平显著升高；IL-1β、IL-18、NLRP3、pro-Caspase-1、pro-IL-1β、Caspase-1 p10蛋白的表达水平升高。