珍稀濒危南药白木香沉香倍半萜合酶（ASS）基因的功能研究

国产沉香来自珍稀濒危植物白木香Aquilaria sinensis。白木香树体只有受到伤害胁迫时才在伤口周围细胞中产生沉香倍半萜等药效成分，但是伤害诱导沉香倍半萜的生物合成途径至今尚未揭示，制约了稳定、高效白木香结香技术的建立。为揭示伤害诱导白木香结香的分子机理，课题组前期采用高通量转录组分析技术（RNA-seq）构建了8万余条伤害、健康白木香转录组测序文库，筛选到了2条伤害诱导的沉香倍半萜合酶基因（ASS）。本项目将采用qRT-PCR技术明确ASS基因的伤害应答时间模式及组织表达模式；运用原核表达及蛋白质纯化技术验证ASS融合蛋白体外合成沉香倍半萜的活性，最后运用基因过表达策略验证外源ASS蛋白在烟草中合成沉香倍半萜的活性。本研究将首次明确伤害诱导的AAS基因功能，初步明确伤害诱导形成沉香倍半萜的分子机理，为高效结香技术体系的建立奠定基础。

项目组采用高通量测序技术获得了包含89,137条伤害、健康白木香EST序列信息库。运用生物信息学和qRT-PCR方法筛选出了参与伤害诱导白木香结香的3条伤害诱导的沉香倍半萜合酶（ASS）基因，体外酶促反应和转基因拟南芥实验证实其能够催化合成δ–愈创木烯、α–愈创木烯和α–葎草烯。外源MeJA处理能够诱导产生相同种类的倍半萜且诱导强度大于伤害处理。MeJA处理同时也能够显著上调转录因子MYB4与WRKY4和蛋白激酶MPKK2与MAPK2，说明ASS基因的表达可能受其调控，本研究初步明确了沉香倍半萜生物合成及调控的分子机理，创新性提出“伤害诱导白木香防御反应结香的假说”。基于该假说，项目组发明了“白木香通体结香技术（Agar-Wit）”，获国家专利授权4项（ZL201220028404.8、ZL200910241212.8、ZL201010104119.5、ZL201120467296.X），申报国际专利8项。该技术能够高效、高产、高质、稳定的生产沉香。2012年该技术已在广东、海南、广西、云南和福建5省示范推广结香96154株，预计2013年底可生产超过价值1亿元的沉香。本项目研究荣获海南省2014年科技进步特等奖1项。