白木香倍半萜合酶基因转录调控元件的克隆及其与转录因子结合特性分析

珍稀濒危植物白木香Aquilaria sinensis是国产沉香的唯一正品植物来源。白木香树体只有受到伤害胁迫后才能启动倍半萜类物质的代谢途径，最终产生沉香。但因该途经在受到伤害后是通过何种调控路径启动的，至今尚未揭示，导致高效稳定结香技术一直没有突破。项目组前期对白木香进行了高通量转录组测序，克隆了倍半萜合酶基因。本项目拟以沉香倍半萜合酶为靶基因开展伤害诱导沉香倍半萜类物质形成的分子机制研究。首先克隆倍半萜合酶基因的转录调控元件；利用酵母单杂交筛选调控其表达的转录因子；通过一系列生化和分子生物学实验研究该转录因子与倍半萜合酶基因启动子的结合特性。本研究将首次明确调控沉香倍半萜合酶的转录因子及其功能，初步揭示伤害信号启动倍半萜合成的分子机制，为高效结香技术的建立奠定基础。

倍半萜合酶基因ASS1是沉香倍半萜合成的关键基因。对ASS1原核诱导表达和纯化，纯化的蛋白用于体外催化，进行功能检测。以法尼基焦磷酸FPP为底物，参照Kumeta & Ito (2010) 方法，对体外催化反应产物进行GC-MS分析。结果检测到三种倍半萜类物质，分别为δ-愈创木烯、β-榄香烯和α-愈创木烯，说明克隆的沉香倍半萜合酶基因ASS1编码有功能的蛋白—沉香倍半萜合酶ASS1。ASS1转录水平的表达受伤害处理和茉莉酸甲酯的显著诱导，GC-MS测定MJ处理的愈伤组织中的倍半萜成分显示，三种受诱导的倍半萜成分与ASS1体外催化产物一致，表明ASS1是沉香倍半萜合成的关键酶基因。为了研究ASS1转录水平的调控，利用染色体步移法对其启动子进行了克隆，得到ATG上游长1055bp的启动子序列。软件分析表明，ASS1启动子区富含伤害相关的转录因子特异识别的顺式作用元件。将启动子分成四段，分别构建与GUS融合的表达载体，转化拟南芥以鉴定启动子的主要功能片段。结果表明，全长启动子几乎没有活性，但从ATG上游731bp到-191bp三段，GUS的时空表达特性几乎完全一致。通过转录组数据分析及荧光定量PCR检测，得到一系列受伤害及茉莉酸甲酯诱导的转录因子，在此基础上，初步提出了“伤害→内源伤害信号分子→转录因子→倍半萜合酶基因→倍半萜”的分子调控机制图。利用SMART cDNA文库构建试剂盒，成功构建了伤害白木香的cDNA文库。酵母单杂交结果显示，ASS1启动子能够与转录因子MYC2和WRKY4互作，低浓度的茉莉酸甲酯能够促进它们的互作。将转录因子MYC2进行了原核表达，纯化的融合蛋白用于制备抗体。为后续进一步从生化水平研究转录因子对ASS1的转录调控机制奠定基础。为全面揭示倍半萜的合成和调控机制，在本基金的资助下，还对沉香倍半萜合成途径中的关键合成酶基因HMGR和DXPS进行了克隆和分析。克隆到2条HMGR基因的全长cDNA序列和3条DXS基因的全长cDNA序列，并对它们的组织表达特性及响应伤害处理的表达模式进行了分析。