棉铃虫田间种群Cry1Ac显性抗性基因的分离与鉴定

The Bt cotton planted in China mainly produce Bt toxin Cry1Ac to control the target pest, cotton bollworm (Helicoverpa armigera). Thus, evolution of resistance to Cry1Ac by H. armigera field populations increases threat to cotton production. Among the Cry1Ac resistant individuals, those carrying dominant resistance genes can survive on Bt cotton plants, and accelerate the evolution of resistance. Previous work have identified a trend of dominant resistance evolution in the field populations from northern China. However, the mutation type and frequency of the dominant resistance genes are not yet clear. In this study, we will isolate the resistant individuals carrying dominant resistance genes from the field populations in northern China. QTL mapping and map-based cloning will be used to determine the mutant genes linked to dominant resistance at the genetic level. The CRISPR/Cas9 technology will be used to test the resistance function of the mutant genes at the biological level. Finally, We will develop the mutation-based screening methods, and obtain the field frequency of different dominant resistance alleles. The dominant resistance results in this study can not only provide theoretical and technical support for the development of effective proactive resistance management strategies, but also provide a new sight for researching molecular mechanism of Bt resistance.

Bt毒素Cry1Ac仍是我国现行Bt棉产生的主要抗虫毒素。棉铃虫田间种群对Cry1Ac的抗性演化给棉花生产带来严重威胁。在棉铃虫田间抗性个体中，携带显性抗性基因的个体可在Bt棉上存活，加速Bt抗性的演化。前期研究已经发现，我国北方棉区棉铃虫田间种群存在显性抗性演化趋势，然而，显性抗性基因的种类和频率尚不清楚。本项目拟从我国北方棉区棉铃虫田间种群中直接分离携带Cry1Ac显性抗性基因的抗性个体，随后对显性抗性基因进行QTL定位和图位克隆，在遗传水平确定与显性抗性连锁的突变基因；利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对突变基因的抗性功能进行验证，在生物水平明确显性抗性基因对Cry1Ac抗性的贡献。在此基础上建立显性抗性基因分子检测技术，获得显性抗性基因的田间频率。本项目的显性抗性研究成果可为制定针对性抗性治理策略提供理论和技术支撑，还可为研究Bt抗性分子机理提供新靶标。

我国华北棉区棉铃虫田间种群对Bt棉表达的Cry1Ac毒蛋白抗性处于持续进化中，而Bt抗性基因四跨膜蛋白HaTSPAN1点突变频率的上升介导了Bt显性抗性个体比例的增加，加速了抗性进化，严重威胁Bt棉的使用寿命。HaTSPAN1基因突变介导的Cry1Ac抗性水平为125倍，说明田间种群中存在非HaTSPAN1显性抗性基因，但种类和频率尚不清楚。本项目从北方棉区棉铃虫田间种群中分离到了携带Cry1Ac显性抗性基因的抗性个体，比例为86.8%。对部分抗性个体进行筛选和纯化，获得了抗性纯合品系。对抗性品系携带的显性抗性基因进行了QTL定位，发现抗性基因主要位于10号和9号染色体上。10号染色体上的抗性基因鉴定为HaTSPAN1，9号染色体上的抗性基因位于1.9-3.3Mbp的QTL位点内。通过图位克隆发现，该QTL位点内组蛋白甲基转移酶复合体亚基基因ASH-2存在碱基突变T102G，编码氨基酸点突变D34E，该突变与Bt显性抗性紧密连锁，可能介导了对Cry1Ac的显性抗性。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对该突变基因进行敲除，发现该基因缺失造成抗性品系死亡，难以检测抗性水平。基于突变基因序列建立了DNA分子检测技术，发现北方棉区棉铃虫田间种群抗性个体中分别携带HaTSPAN1和ASH2氨基酸突变的个体比例分别为2019年79.9%和6.25%，2021年87.6%和6.19%，无显著性变化。项目结果可为动态监测棉铃虫田间种群显性抗性进化提供技术支撑，为制定针对北方棉区棉铃虫的Bt抗性治理策略提供理论依据。