肠道菌介导的人参多糖肿瘤免疫治疗增效作用及机制研究

Immunotherapy tolerance is a huge block in the antitumor therapy. Our previous study found that ginseng polysaccharides (GP) could enhance the tumor immunotherapy effect of CpG oligodeoxynucleotide(CpG-ODN) on gut microbiota dysbiosis mice, but the mechanisms involved are unknown. In this project, the gut microbiota dysbiosis mice that bear MC38 tumor are built by antibiotics according to ABX guideline. The model mice will been treated with GP and CpG-ODN. The normal data such as tumor inhibition rate is used to evaluate the antitumor enhancement; 16S rRNA gene sequencing and metagenomics will be applied to study the microbiota diversity and function; LC-QTOF-MS and GC-MS will be applied to profile the gut microbiota metabolites including short-chain fatty acids (SCFAs). The modern molecular biotechnologies such as FCM、ELISA、WB、IHC will be applied to test T cells and dendritic cells, TLRs、 NF-κB and cytokine expressions, so as to validate following scientific hypothesis: the enhanced antitumor effects of GP on CpG-ODN immunotherapy are related to the modulation of the diversity and function of gut microbiota and its metabolites, thus consequently affect the TLRs-NF-κB signal pathway of CpG-ODN immunotherapy. The outcomes of this study would provide scientific evidence for GP as an inmmunoadjuvant in tumor immunotherapy, and also offer a new strategy for the innovate study on tumor immunotherapy.

肿瘤免疫治疗耐受是亟待解决的难题。我们研究发现，人参多糖(GP)联合免疫激活剂CpG-ODN具有肿瘤免疫治疗增效作用，但机制有待深入研究。本项目拟采用抗生素联用菌群失衡MC38结肠癌小鼠模型，以抑瘤率等指标评价抗癌增效作用；采用16s rRNA测序技术及宏基因组学方法研究肠道菌群多样性及功能，采用LC/GC-MS联用技术研究短链脂肪酸（SCFAs）等肠道菌代谢产物；采用FCM、ELISA等分子生物学技术研究CD4+T、DC免疫细胞功能、TLRs、NF-κB蛋白表达及MyD88、TNF-α等因子水平，验证如下假说：GP通过调节肠道菌群结构、功能及其代谢物SCFAs水平等影响CpG-ODN基于TLRs-NF-κB的肿瘤免疫治疗信号通路达抗癌增效作用。通过该假说的验证揭示肠道菌介导的GP协同CpG-ODN抗癌增效机制，为GP成为肿瘤免疫治疗佐剂提供科学依据，也为肿瘤免疫治疗创新研究提供新思路。

肠道菌群失衡削弱肿瘤免疫应答，易导致肿瘤免疫治疗耐受。我们前期研究发现，人参多糖(GP)联合免疫佐剂CpG ODN具有肿瘤免疫治疗增效作用，由于GP同时具有肠道菌群调节作用，因此，本项目主要围绕GP联合免疫佐剂抗肿瘤增效作用及肠道菌介导机制展开研究。首先我们建立了联合抗生素诱导的菌群失衡MC38荷瘤小鼠模型，证实肠道菌群失衡影响肿瘤生长，其机制与肠道菌干预宿主脂质及氨基酸等能量代谢及肿瘤免疫微环境有关。随后在CpG ODN免疫佐剂治疗研究中，结果显示菌群失衡降低其抗肿瘤效果，人参多糖联用具有协同增效作用。通过开展基于16S rRNA及宏基因组学测序技术研究肠道菌群多样性及功能；采用基于UPLC-MS技术的靶向代谢物检测及非靶向代谢组学方法，研究小鼠肠道、血浆及肿瘤组织的SCFAs水平及代谢特征；采用qRT-PCR、ICH、FC、ELLISA等方法研究肿瘤微环境中蛋白、细胞因子及免疫细胞的表达水平，通过肠道菌宏基因组功能分析、肠道菌-环境因子关联分析及粪菌移植验证等，揭示了人参多糖通过增加肠道菌群多样性及调节Lactobacillus、Bifidobacterium、Proteus等肠道菌丰度及功能，干预菌群失衡荷瘤小鼠肠道、血浆及肿瘤组织的SCFAs水平、甘油磷脂代谢、初级胆汁酸代谢、鞘脂代谢等过程，影响宿主及肿瘤代谢过程，抑制肿瘤免疫微环境中TLRs-MyD88-NF-κB信号通路的过表达，重建免疫微环境中IFN-γ、IL4、IL12、IL17、IL1-β和TNF-α等细胞因子构成，下调MDSC、Treg表达水平，提高Th17表达水平，缓解免疫微环境的抑制状态，发挥抗肿瘤协同增效的作用机制。通过本项目的研究证实了肠道菌群在肿瘤免疫治疗过程中的重要性及人参多糖协同免疫佐剂发挥协同增效作用的肠道菌介导机制，为其肿瘤免疫治疗佐剂联合用药提供科学依据，也为中医药肿瘤免疫治疗创新研究提供了新思路。