萜类合成途径限速酶对雷公藤次生代谢的影响

The research and application of plant secondary metabolites are hindered by limiting plant resources and vague secondary metabolites biosynthesis pathways. The precedent results showed that the biosynthesis of terpenoids proceeds via the mevalonate (MVA) pathway and the pyruvate/glyceraldehydes-3-phosphate pathway in Tripterygium wilfordii Hook.f.. The 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase (HMGR) and 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase (DXR) are the rate-limiting enzymes on terpenoids secondary metabolites in T. wilfordii. This project will clone 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase (HMGR) and 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase (DXR), combine with the technologies of rapid-amplification of cDNA ends (RACE), RNA interference (RNAi), overexpression, real-time PCR and high-performance liquid chromatography (HPLC) and genetic transformation of HMGR and DXR in Agrobaterium rhizogenes and bioassays on insecticidal activity for elucidating the regulation of HMGR and DXR in terpenoids biosynthesis in T. wilfordii. The results will provide the knowledge of in vitro cultures to solve limiting plant resources, genetic transformation to demonstrate terpenoids biosynthesis pathway and application of secondary metabolites in T. wilfordii.

植物资源有限性与次生代谢产物生物合成途径不明确是制约植物次生代谢物研究与开发的瓶颈。前期研究结果表明，雷公藤萜类化合物生物合成途径涉及甲羟戊酸代谢途径和丙酮酸／磷酸甘油醛代谢途径，而3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)和5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶(DXR)是这两个代谢途径中的两个关键酶，即雷公藤萜类化合物的生物合成可能由这两个关键酶所调控。本项目拟从克隆3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)和5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶(DXR)出发，结合RACE、RNAi、过量表达、Real-time PCR以及HPLC等技术，同时采用发根农杆菌遗传转化与杀虫生物活性测定来阐明HMGR和DXR基因在雷公藤萜类化合物生物合成中的功能，为解决雷公藤植物资源有限性、阐明雷公藤萜类化合物的生物合成途径与开发利用雷公藤植物资源奠定基础。

雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook.f.）系卫矛科雷公藤属植物，其提取物在农业和医学上具有广泛的作用。本项目通过RACE(rapid-amplification of cDNA ends)技术，获得了雷公藤植物萜类生物合成途径限速酶HMG-CoA还原酶（HMGR）和5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶(DXR)基因全长序列，分析表明，雷公藤HMGR基因与龙眼、荔枝等HMGR基因具有较高的相似性，在不定根和叶组织中有较高的表达；Ag+，MeJA和壳寡糖可诱导其提高表达并促进雷公藤内酯醇、吉碱和次碱的合成；雷公藤DXR基因与巴豆、橡胶树等DXR基因具有较高的相似性，在雷公藤叶和根组织中有较高的表达；Ag+和MeJA也可诱导其表达并促进雷公藤内酯醇和次碱合成。.通过构建过量表达和RNAi载体，转化雷公藤愈伤组织获得发状根，选择生长良好的HMGR与DXR基因的过量表达和RNAi株系各3株进行分析，数据表明，过表达TwHMGR发状根株系中，TwHMGR基因表达量分别提高2.68-4.73倍，内酯醇含量分别提高1.06-1.46倍、吉碱含量分别提高0.89-1.16倍和次碱含量分别提高1.43-2.41倍；过表达TwDXR发状根株系中，TwDXR基因表达量分别提高3.66-5.81倍，内酯醇含量分别提高1.49-2.38倍、吉碱含量分别提高1.22-1.38倍和次碱含量分别提高1.14-1.47倍；在雷公藤TwHMGR和TwDXR基因RNAi株系中，目的基因TwHMGR和TwDXR的干扰效率在20%-60%，其中TwHMGR基因表达下调在H-RNAi-1中最低至对照的38.78%，其内酯醇、吉碱和次碱降低53.45%，66.85%和68.17%；TwDXR基因表达下调在D-RNAi-3中最低至对照的47.28%，内酯醇、吉碱和次碱降低65.39%，48.70%，36.58%。.以上结果表明，HMGR和DXR基因的过表达和下调，都会引起内酯醇，吉碱和次碱的含量上升和下降，说明在雷公藤中，HMGR和DXR所在的MVA和MEP途径参与了雷公藤萜类物质的生物合成，TwHMGR基因对倍半萜生物碱的合成起影响较大，而TwDXR对雷公藤二萜的影响较大。研究结果为阐明雷公藤萜类物质生物合成代谢途径以及利用代谢工程和合成生物学方法获得其高活性化合物提供基础。