一步等温基因快速检测方法的建立及应用

Genetic testing is playing a more and more important role in disease diagnosis, food safety, environmental monitoring and so on. The currently widely used genetic testing technology is TaqMan, which is based on PCR method and has high sensitivity and good specificity. However, TaqMan probe is very expensive and relies on special instruments for signal detection, moreover, this method is protected by patent. Spurred by these drawbacks, a lot of isothermal amplification methods have been developed, which do not rely on expensive apparatus and specialized talent. Regrettably, these methods need preheat before reaction and lack simple signal report means. Therefore, we plan to establish a new simple genetic testing method which conduct DNA amplification in isothermal condition and detect signal by color in order to reduce the cost of genetic testing and realize on-site test.

基因检测在疾病诊断、食品安全、环境监测等方面起着越来越重要的角色。目前应用最成熟和广泛的基因检测技术是基于PCR扩增的TaqMan探针技术，具有灵敏度高且特异性好的优点。但TaqMan探针技术受国外专利保护，而且探针费用昂贵和依赖精密的荧光定量PCR仪器导致基因检测成本非常高，这促使了等温扩增技术的发展。等温扩增技术具有不依赖昂贵仪器、操作简单、反应快速等优点。然而，这些方法普遍只能以单链DNA作为初始模板，或者需要加热预变性才能扩增基因组DNA或环状质粒DNA这类长片段模板，而且普遍缺乏简单直观的信号报告方法。本项目针对目前基因检测方法存在的上述诸多问题，拟发展一种新的在等温条件下进行DNA扩增，以核酶催化显色反应为信号报告方式的一步等温基因快速检测技术，以期降低检测成本和实现基因的现场快速检测。

基因检测技术在食品、环境、健康等方面的作用越来越受到人们的重视。目前针对疾病与用药（如遗传病、病原体、靶向药物相关位点）的基因检测主要依靠以PCR作为扩增手段、以特异荧光探针（如TaqMan）进行信号报告的实时PCR荧光检测。该方法虽然灵敏度高，但所使用的核酸探针需经过化学改性，同时还依赖精密控温的荧光PCR仪，使得开展相关基因检测所需成本高昂、对实验条件要求较高，再加上专利保护的因素，致使检测成本居高不下。因此，许多不依赖热循环的等温扩增方法产生了，如目前应用较广泛的RPA、LAMP、NASBA等，这些方法利用特定功能的酶或独特的引物设计使扩增反应能在一个恒定的温度下进行。然而这些方法存在一些缺点，如反应成分复杂或缺乏特异性的报告方法。.基于RPA反应和LAMP反应，我们首先用重组酶打开双链目标DNA，然后内引物再结合目标DNA进行延伸，通过多轮循环，就能得到大量哑铃状结构单链DNA，引发下游超指数的环介导扩增。此方案能减少引物的数量，降低引物二聚体以及引发非特异性扩增的概率。为了进一步增加方法的特异性，我们在扩增过程中加入了一种特异性的荧光能量共振探针，以增加反应的特异性。