P3蛋白在芜菁花叶病毒致病过程中的功能与机制研究

Turnip mosaic virus (TuMV) is one of the most widespread and economically important viruses and infects a wide range of plant species, most from the family Brassicaceae. P3, one of the most variable proteins of potyviruses, is involved in pathogenicity of TuMV. Recently, a small open reading frame, termed 'pipo', is detected to be embedded in the P3 cistron of potyviruses, and is expressed in planta as a protein fused to the N-terminus of P3 (P3N-PIPO). Therefore, the function and mechanism of P3 protein in the pathogenicity of TuMV become more complex and important. We have obtained two TuMV basal-BR isolates with significant difference in pathogenicity in China, and determined their complete genome sequences. The preliminary data showed P3 is the determinant in pathogenicity of TuMV. In this project, we will map the important amino acids and motifs involved in the pathogenicity of P3 and study the underlying mechanism by chimeric virus construction, site-directed mutagenesis, yeast two-hybrid system and BiFC technology. The expected results will provide novel information about TuMV pathogenicity and hints to explore strategy for the virus disease control.

芜菁花叶病毒 (TuMV) 寄主范围广泛，是危害蔬菜最严重的病毒之一。TuMV编码的P3蛋白容易变异，对其结构和功能缺乏规律性认识。最近发现的P3N-PIPO蛋白是P3编码区内ORF翻译形成的，因此，P3蛋白在致病过程中的功能可能存在更为复杂的机制。申请者已获得两个致病性差异明显的TuMV basal-BR分离物全基因组序列，并证明P3是影响TuMV致病性的决定簇。本项目拟以含有两分离物P3基因的侵染性克隆为材料，利用反向遗传学、酵母双杂交与双分子荧光互补技术，比较突变体接种寄主后的症状表现、病毒RNA复制水平、移动能力及P3和P3N-PIPO蛋白的表达等差异，分析P3蛋白及其突变体在植物亚细胞定位及其与自身编码蛋白的互作，明确P3蛋白在致病过程中的功能及机制。在理论上可明确TuMV致病的分子机制，在实践上为探索有针对性的控制策略提供科学指导。

芜菁花叶病毒 (Turnip mosaic virus, TuMV )是马铃薯Y病毒属（Potyvirus）的重要成员。TuMV基因组是正义单链RNA，包含一个大的开放阅读框（ORF），近年又发现在 P3 蛋白编码区内部存在一个较短的ORF，通过核糖体移码策略翻译形成P3N-PIPO 蛋白。P3蛋白是该病毒编码的一个重要蛋白，对其结构和功能了解较少。本研究首先对TuMV的变异进行了分析，在此基础上，对P3蛋白及其他编码蛋白与拟南芥AtSWEET1蛋白的互作进行了研究，对P3基因进行定点突变验证其对病毒致病性的影响，另外，对P3N-PIPO基因中PIPO进行渐变缺失，证明了P3N-PIPO在马铃薯Y病毒属病毒移动方面的功能。.本研究分离获得22个TuMV分离物。克隆并测序得到22个p3基因和3个分离物的全基因组序列。系统进化分析表明，所有的分离物均形成5个组，本研究获得的分离物均属于basal-BR组。中国分离物存在负向选择。P3N-PIPO、P1 和 P3 基因承受的选择压力更大，P3承受选择压力绝大部分来源于P3N-PIPO所产生的选择压力。.利用TuMV p3基因N端663 bp大小的片段进行原核表达，利用表达的蛋白制备特异性抗血清。.为了解TuMV P3蛋白与寄主植物之间的互作，通过酵母双杂交融合的方法，从拟南芥酵母双杂交cDNA文库中筛选到一个与P3蛋白互作的糖转运蛋白（AtSWEET1），并用共转化和BiFC验证进一步验证P3蛋白与AtSWEET1蛋白互作。AtSWEET1和p3基因N端663 bp同样互作。亚细胞定位证明二者均存在于本生烟表皮细胞的细胞膜上。利用酵母双杂交和BiFC方法证明除了P3蛋白，还有HC-Pro、VPg和NIa-Pro与AtSWEET1蛋白互作。.P3与P3N-PIPO在与寄主的互作上有着密不可分的联系。因此我们开展了P3N-PIPO在病毒致病过程中的功能研究。利用构建的TVBMV侵染性克隆为材料，对TVBMV病毒的PIPO基因进行渐变缺失，证明了有移动活性的PIPO至少需要58个氨基酸。本氏烟中的NbDREPP可以与P3N-PIPO互作，在TVBMV移动中起关键作用。.本研究结果为进一步探索TuMV 与寄主的互作机制及其在TuMV致病过程中的功能提供了有利的理论基础。