基于FRET原理的高灵敏度DNA纳米荧光探针的合成及性能研究

Infections caused by Hepatitis B Virus (HBV) and Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) have been considered the most difficult to treat, along with the AIDS disease. Early and accurate detection of the DNA sequences of the virus or bacteria is extremely important for the disease diagnosis as well as treatment. The current DNA detection methods in clinical application suffer from high cost and they are prone to false positive results. This project aims to design and construct a novel FRET-based upconversion nanoprobe for highly sensitive HBV and MRSA DNA detection. Rare-earth upconversion nanophosphors are well-known for their narrow absorption and emission bands, high chemical stability, low biological toxicity, etc. Up-conversion Nanoparticles (UCNPs) will be used as the energy donor and organic dyes or Au nanoparticle as the energy acceptor for the FRET-based nanoprobe. Systematic studies on the parameters such as the emission intensities of the UCNPs, the size of the nanoparticle, the distance between the energy donor and the acceptor will be carried out in order to achieve an efficient FRET process for DNA detection. This novel nanoprobe may lead to improved HBV and MRSA detection and extend the applications of rare-earth up-conversion nanophosphors in the biological aspects.

目前，乙肝（HBV）、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）已和艾滋病成为世界三大最难解决的感染性疾病，及早和准确的检测引起这些疾病的DNA序列对于乙肝及MRSA患者的诊断和治疗具有重要意义。本项目针对目前临床中乙肝及MRSA病毒DNA检测技术要求高、误差大、易出现假阳性结果等问题，设计构筑以稀土上转换发光纳米粒子作为能量给体，有机染料或金纳米粒子作为能量受体的基于荧光共振能量转移（FRET）原理的高灵敏度DNA纳米荧光探针，系统研究FRET过程相关因素的影响，建立上转换纳米粒子发光强度、粒径尺寸、能量给体与受体间距离、能量传递效率与检测灵敏度之间的相互关系，筛选出高灵敏度、高选择性识别HBV-DNA及MRSA-DNA的杂化纳米探针，实现乙肝、MRSA病毒DNA的痕量检测。本研究将对拓展上转换发光材料在生物方面的应用，扩展DNA的检测手段，及对乙肝、MRSA传染病的诊断和治疗具有重要意义。

稀土上转换发光纳米粒子（UCNPs）具有光稳定性好、潜在生物毒性小、光穿透深度高、无生物背景荧光干扰等优势，在发光检测、生物成像、光动力治疗等方面具有广泛的应用。本项目以UCNPs作为能量给体，有机荧光染料，碳纳米角，氧化石墨烯等作为能量受体，制备了一系列基于发光共振能量转移（LRET）的纳米复合探针，实现了DNA序列（PML/RARα融合基因片段，乙肝病毒DNA片段），生命所需微量元素Cu2+，重金属污染物Pb2+等的检测，部分探针实现了细胞成像。该研究工作对丰富荧光检测手段，拓展UCNPs的应用领域具有较好的影响和意义。.（1）以柠檬酸改性的稀土上转换发光纳米粒子（Cit-UCNPs）作为能量给体，单壁碳纳米角（SWCNHs）作为能量受体，制备了基于发光共振能量转移（LRET）的纳米平台（nanoplatform），实现了急性早幼粒细胞白血病PML/RARα融合基因的高灵敏度上转换发光“Turn-On”型检测。.（2）通过配方的调整，合成了一系列不同SiO2包覆层厚度的UCNPs@SiO2纳米粒子，选取SiO2包覆层厚度为1 nm的UCNPs@SiO2纳米粒子作为能量给体，将其与capture oligo进行共价键嫁接，构成纳米探针的一端，纳米探针的另一端由键合有羧基四甲基罗丹明荧光染料的report oligo构成，制备了三明治类型纳米探针，实现了乙肝病毒DNA片段的上转换发光检测。.（3）基于软硬酸碱理论，设计合成了一个具有对称结构的新颖的荧光探针分子，该分子含有两个罗丹明荧光团，获得了该分子的X射线单晶结构。该荧光探针分子实现了铜离子的荧光检测，检测限达38.00 nM，实现了细胞内Cu2+的荧光成像。.（4）针对部分罗丹明类荧光探针不能选择性识别Cu2+与Hg2+，本部分工作通过探针分子结构上的单原子改变，并进一步与介孔SiO2改性后UCNPs共价键组装，制备了基于LRET原理的有机-无机杂化纳米探针，实现新探针体系对铜离子的专一性识别，并进行了细胞中铜离子荧光成像研究。.（5）选取具有特异性结合Pb2+的DNA序列，将其与作为能量给体的UCNPs进行共价键键合，以单壁碳纳米角（SWCNHs）、氧化石墨烯（GO）为能量受体，通过π-π键相互作用制备了基于LRET的纳米探针，实现了对重金属Pb2+的上转换发光检测。