无毒基因AvrPiz-t变异过程中稻瘟病菌基因组微进化特点研究

It is well known that interaction of resistance gene in rice and avirulence gene in Magnaporthe orayze follows the gene foe gene theory. With the long term R- avirulence gene interaction, rice blast disease epidemics shows as boom-bust cycle through host and pathogens coevolution. In general, it is easy to understand that with high selective pressure from host R gene the avirulence gene will be under a frequent structural variation leading to loss of avirulence function. However it is really difficult but worth to study the mechanism of how the rice blast pathogen can adapt to newly developed environment niche with the non-functional avirulence gene. In our case, on the basis of our previous cloned AvrPiz-t and AvrPiz-t mutantion survey project, we will conduct a combined genome DNA Pool-sequencing and genome-wide association study with the natural, historical and artificial population of rice blast fungus to fine-map the positive selection candidates, selective sweep region or newly-gained putative effector proteins at the whole genome level. Furthermore we will try to interpret the molecular adaptation mechanism why AvrPizt(-) rice blast pathogen can gain constitutive virulence in new environment. Our research proposal will intend to uncover the genome microevolution of the fungal pathogen during the new developed environment and provide new theory to designa better and suswtainable strategy to manage the rice blast disease.

水稻抗病基因和稻瘟病菌无毒基因的相互作用，符合经典的“基因对基因”关系，抗病基因和无毒基因长期相互作用中，水稻和稻瘟病菌表现出繁荣-衰败（Boom-Bust）循环之寄主和病原物共同进化的特点。在抗病基因的选择压力下，稻瘟病菌的无毒基因容易发生结构变异导致功能丧失，无毒基因功能丧失后的稻瘟病菌群体在不断适应新环境中是否分化出新的分化位点值得探讨。本项目拟在我们克隆了稻瘟病菌无毒基因AVRPiz-t及自然群体中AVRPiz-t变异特点基础上，采用基于群体基因组混合池测序和全基因组关联分析方法在稻瘟病菌自然群体、历史群体、人工群体中，研究在无毒基因AVRPiz-t变异后稻瘟病菌群体在不断适应新环境中毒性增强的分子机制，分析潜在强烈分化位点，分析群体中可能获得的新的效应因子，为揭示无毒基因与抗病基因互作过程中病原菌基因组适应新环境微进化的规律奠定基础，还可以为制定稻瘟病可持续治理策略提供理论依据。

稻瘟病菌群体的不稳定性，及其致病相关因子的高度可变性，常导致水稻抗病品种抗病性的丧失，因而迄今仍无法准确地预测新的水稻品种可以大面积推广使用的年限。研究稻瘟病菌群体与水稻互作过程中基因组水平上基因突变及其对群体变化的影响，有助于增进对病原菌致病性变异的分子机制的认识、有助于解析生物表型变异的复杂遗传机制，而且对制定持久有效的抗病育种策略具有重要意义。本研究明确无毒基因AvrPiz-t 在稻瘟病菌自然群体中的演化方式，以及基因变异后的稻瘟病菌群体基因组变化，阐明宿主专一性分化与无毒基因AvrPiz-t的演化关系。对福建采集的连续14年菌株接种发现AvrPiz-t的有毒性频率从12.5%上升到100%，而福建地区主栽水稻品种中普遍存在相应的水稻抗性基因Piz-t，说明水稻抗性基因对稻瘟病菌存在强烈的自然选择。对来自中国各地分布的约800个菌株的研究表明大部分的菌株对Piz-t水稻为无毒。在有毒菌株中，AvrPiz-t菌株的变异方式为启动子区或者ORF区的转座子插入，且变异上存在地区特异性，这些结果明确了AvrPiz-t在自然群体中的主要演化方式。与Ohio State University的Thomas Mitchell团队合作扩大了稻瘟病菌群体的数量和地域范围，对全球38个国家或地区的样本进行分析获得了AvrPiz-t编码区的8种变异类型。选择65个来自不同年代、采集地或宿主的代表性菌株进行全基因组测序，并对AvrPiz-t基因位点的上下游进行分析，发现其位点周边序列存在很高的保守性。比对两个菌株的差异基因组获得了两个相应菌株的差异候选效应蛋白，并对这些候选效应蛋白进行了功能验证。通过人工模拟的方式获得了稻瘟病菌连续世代接种水稻后的人工群体。对不同禾本科宿主来源的稻瘟菌株进行基因组分析，发现AvrPiz-t在序列上只有微小的差异，表明该基因的存在早于宿主专一性。AVR-R基因经历了长期的互作与共进化过程，然而该基因的突变率却远小于稻瘟病菌基因组的变异。本项目对稻瘟病菌一个无毒基因AvrPiz-t展开了系统性的研究，并对其进化过程中伴随的基因组变异进行了研究，揭示了无毒基因变异过程中基因组的动态变化，以及变异后稻瘟病菌对新环境的适应机制，从病原菌角度为最终实现稻瘟病菌的生态防控奠定了坚实的理论基础。