复杂酶反应体系的抑制效应解析与关键路径的加速

将多种不同类型和功能的酶组合成一个能够高效完成特定目标产物合成的复杂酶反应体系是生物工程中极具挑战性的课题之一。多种酶之间复杂的相互作用、抑制效应和限制性因素的解析以及基于解析结果的过程强化是复杂酶反应体系研究面临的主要问题。本项目以DNA扩增前提材料脱氧核苷三磷酸(deoxynucleoside triphosphate, dNTP)的生物全合成反应网络为模型，对复杂酶特别是关键路径酶反应之间的相互作用、抑制效应与反应协同等因素进行动力学分析，找出特定复杂酶反应体系的限制性因素；采用基于进化树分析和分子定向修饰的非特异性酶基因替换策略对复杂酶反应体系进行简化；基于上述研究，对复杂酶反应网络进行有效的协同与优化，实现体系限制性步骤的加速。研究结果对一般性复杂酶反应体系的抑制效应机理和限制性步骤加速具有普遍意义，为该体系在大尺度生物基产品生产过程上的应用提供基础研究支持。

本课题以生物全合成反应网络和生物质降解酶系为模型体系，对复杂酶反应之间的抑制效应、酶相互作用、反应协同等限制性因素进行了研究，对复杂酶反应体系的关键路径酶进行了改造，降低了产物抑制并实现了限制性步骤的加速。获得了4种具有明显底物非特异性的关键路径酶：对dADP、dGDP、dCDP、dTDP四种不同底物具有活性的丙酮酸激酶；对果聚寡糖、葡萄糖寡糖两种菊糖具有明显活性的葡萄糖糖化酶；对蔗糖和果聚寡糖具有明显活性的蔗糖酶；对纤维素末端糖苷键和内部糖苷键具有明显活性的纤维素内切酶。获得了4条非特异性关键路径酶反应体系：从4种脱氧核糖二磷酸(dADP、dGDP、dCDP、dTDP)底物用丙酮酸激酶转为4中脱氧核苷三磷酸(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)；用非特异性葡萄糖糖化酶同步催化菊芋中的果聚寡糖和淀粉中的葡聚寡糖同时生成果糖和葡萄糖单糖；用酿酒酵母中的蔗糖酶催化菊芋中的果聚寡糖生成果糖并发酵生成乙醇；用纤维素内切酶降解磷酸浸泡纤维素，在末端和内部纤维素糖苷键同时作用。在微生物与酶工程国际权威学术期刊上发表本课题相关联的SCI论文16篇。