基于NOX4-ROS-AMPK/ASK1信号通路研究甲基阿魏酸抗酒精性肝病的作用及机制

Ethanol can induce high expression of hepatic NADPH Oxidase 4 (NOX4), induce the generation of ROS, which can interfere with ASK1 and AMPK signaling pathway, leading to the apoptosis of liver cells and fat accumulation，and these are major cause of alcoholic liver disease (ALD)， Our research found that methyl ferulic acid (MFA) has a good protective effect on ethanol-induced fatty liver. Our vivo experiments show that MFA could significantly improve the activity of antioxidant enzymes and has protective effects on the liver. In the pre-experiment, we were surprised to find that MFA can inhibit the apoptosis of SK-HEP-1 cells, inhibit NOX4, p22phox mRNA expression, reduce ROS production, inhibit ASK1 pathway but activate AMPK signal.. Therefore, MFA is most likely to be a good new drug for the treatment of alcoholic liver disease. This study intended to explain how MFA works on the pathway of NOX4-ROS-AMPK/ASK1 and its molecular mechanisms by using NIAAA mouse model and ALD cell model, combining with the technology of NOX4, p22phox RNAi interference and overexpression. It is very important for elucidating the pathogenesis of ALD and clarifying the mechanism of the effect of MFA on ALD.

乙醇诱导肝内NADPH氧化酶4(NOX4)高表达而产生大量活性氧(ROS),ROS干预AMPK及ASK1信号通路,介导甘油三脂堆积和肝细胞凋亡是酒精性肝病(ALD)发病的重要原因。在前一课题研究中发现甲基阿魏酸(MFA)有抑制脂肪肝作用，预实验中我们惊奇地发现MFA有抑制乙醇诱导SK-HEP-1细胞凋亡，减少细胞内ROS生成，抑制NOX4和p22phox表达，调控AMPK和ASK1的磷酸化的作用。MFA有望成为良好的抗ALD药物，推测其机制与调控NOX4-ROS-AMPK/ASK1信号通路有关。本项目拟采用酒精性肝病SK-HEP-1细胞模型及NIAAA小鼠模型,结合NOX4、p22phox RNAi干扰和过表达技术,阐明MFA调控NOX4-ROS-AMPK/ASK1信号通路的分子机制。该研究对阐明ALD发病机制,明确MFA抗ALD的作用及机制有重要意义。

项目的背景.ALD的发病率在我国成逐年上升趋势，已成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝脏疾病，严重危害人民身体健康，目前酒精性肝病的治疗尚缺乏有效的方法。目前已知NOX4-ROS-AMPK/ASK1信号通路从细胞损伤、凋亡、脂肪生成等多个方面参与ALD的形成过程的。通过应用药物来抑制NOX4-ROS-AMPK/ASK1信号通路传导或/和阻断该信号传导级联反应的重要环节，将对控制ALD的发生和发展有极其重要的意义。.主要研究内容：.（1）在NIAAA大鼠模型上评价MFA抗ALD的药效。.（2）阐明NOX4-ROS-AMPK/ASK1通路在各组NIAAA大鼠酒精性肝病发病过程中的变化，评价MFA对其影响效果。.（3）通过乙醇诱导L-02细胞建立酒精性肝病细胞模型，明确NOX4-ROS-AMPK/ASK1通路与ALD关系并阐明MFA抗ALD的作用靶点。.（4）利用NOX4-KO和NOX4过表达小鼠,观察NOX4对药物疗效的影响、ROS生成及对AMPK/ASK1信号通路的改变，评价MFA抗ALD作用。.重要结果：1.本研究首次证明MFA减少乙醇诱导的ROS积累和通过抑制MAPK激活和恢复酒精激活MAPK途径而增加的细胞凋亡，MFA抑制酒精引起的体内肝损伤。MFA对酒精性肝损伤具有保护作用，可作为酒精所致肝损伤的重要保护剂。其作用机制可能与其抗氧化、抗炎、清除脂质的特性及其调节NOX4/ROS-MAPK信号通路的能力有关。.2. MFA通过抑制L-02细胞中ROS依赖的JNK/p38 MAPK和抑制Bcl-2/Bax信号传导途径，对乙醇诱导的细胞活力下降和凋亡发挥有益作用。对MFA的作用有新认识，它通过抑制MAPK信号通路激活来减轻乙醇诱导的L-02细胞凋亡。.3. MFA对乙醇诱导的肝脂肪变性具有很好的保护作用。在体外，MFA处理可降低L-02细胞中TG和TC的含量。在体内，MFA显著改善ALD大鼠的肝脏病理变化并减少其在血清和肝脏中的脂质沉积。在体内和体外，MFA还激活AMPK和FoxO1信号通路，并提高SIRT1，PPAR-α和CPT-1α的表达水平。.以上发现，本课题组认为对NOX4-ROS-AMPK/ASK1信号通路进行调控，是抗ALD药物筛选的关键靶点，对人类认识ALD的发生发展提供了全新的实验和理论基础，对该环节有效调控活性化合物的发现、对预防和治疗ALD有重要价值。