牙本质发育不良I型致病基因的克隆鉴定及功能研究

Dentin dysplasia type I (DD-I) is a rare autosomal dominant inherited disease and has significant genetic heterogeneity. Its clinical features include pulp chambers obliteration, roots short and premature exfoliation of the teeth. We found a Chinese family affected with DD-I. The patients not only have the typical features of DD-I, but also have new phenotypes including amelogenesis imperfecta. We screened the disease related genes (SMOC2, VPS4B, SSUH2) previously reported in DD-I patients, but no pathogenic mutation was found in these three genes in the patients. We then performed whole exome sequencing in 4 patients and 2 normal members in the family together with the bioinformatics analysis. We found a new pathogenic gene of DD-I named UBR5 which is located in 8q22.3. The missense mutation c.2431 A > G (I811V) of this gene exists in all of the patients in the family, but not normal members. In this study we intend to do further research on the function of UBR5, seeking to reveal its pathogenic mechanism. We will study the phenotype of mice with ubr5 defects by constructing the model of ubr5 knock-out mice, observing the biological characteristics of cells and expression level of genes related to dentin development through UBR5 gene silencing and overexpression in odontoblast cell lines .

牙本质发育不良I型（dentin dysplasia I，DD-I）是一种罕见的常染色体显性遗传病，其特点为髓腔闭锁，牙根短小，但具有明显的遗传异质性。我们发现了一例中国DD-I家系，患者除具有DD-I典型表现外，同时伴有牙釉质发育不全等新的表型。我们在家系患者中对已报道DD-I相关基因（SMOC2、VPS4B、SSUH2）进行了突变筛查，但未发现致病突变。随后对家系中4例患者及2例正常人进行了全外显子组测序，并结合生物信息学分析，发现DD-I新的致病基因UBR5，该基因定位于8q22.3，其错义突变c.2431 A＞G(I811V)存在于家系所有患者中，而家系正常个体无上述突变。本研究拟进一步对UBR5进行功能研究，通过基因敲除小鼠模型的建立，研究ubr5缺陷小鼠的表型鉴定；通过ubr5在成牙本质细胞系的沉默及过表达，观察细胞的生物学特性及牙本质发育相关基因的表达水平，力求揭示其致病机制

本项目前期经过外显子组测序及生物信息学分析锁定了目标基因为8q22.3的UBR5基因的c.2431 A＞G(I811V)。项目获批后，研究组成员获得了更多家系样本，使得连锁分析成为可能，但在后续的全基因组扫描结果中共锁定两个可能连锁区域，分别位于5号染色体和11号染色体，而检索目标基因UBR5 所在区域，与连锁区域并不重合。随后，对家系中获取到DNA样本及确定表型的其他6例成员，其中患者2例及正常人4例，在UBR5突变位点上下游各100bp设计引物，进行PCR扩增测序，在家系中进行验证，结果发现患者III-6的UBR5基因的c.2431 A(I811V)，而不是c.2431 A＞G(I811V)，因此尚不支持UBR5作为本家系明确的致病基因。为了进一步寻找、确定本家系中患者牙本质发育障碍的致病基因，我们对家系中1例患者（II-5）和1例正常人（II-9）进行全基因组测序，并对测序发现的变异进行深度分析，在连锁范围内对筛查到的变异进行四步过滤，所有SNP和InDel变异都不在连锁范围内。研究组成员又重新对家系中2例患者（II-5、III-10）和2例正常人（II-9、III-13）进行外显子组测序及家系验证，以期能够获得本家系更为明确的候选基因。.由于家系连锁分析的结果，与前期研究结果综合分析，尚不支持UBR5作为明确的致病基因的结论。家系连锁分析结果与生物信息学分析不匹配的情况影响了后续的功能研究，为保证研究结果的可靠性，需要获取更多家系样本，增加连锁分析结论的有效性，同时对目前连锁范围内的可能致病基因进行深入的生物信息学挖掘，以期获得更为明确的候选基因。因此，目前项目重点工作仍然围绕明确致病基因展开，并与国内相关研究课题组（中国医学科学院-北京协和医学院医学遗传学系张学课题组及南方医科大学医学遗传学教研室熊符课题组）展开合作，以期尽快获得有效的线索，待此工作完成后将按照原定后续计划，通过模式生物，在动物整体水平上研究缺陷动物的表型鉴定；并在细胞水平上观察候选基因的表达，探讨DD-1的致病机制。