烟草病程相关蛋白PR10抗病分子机理研究

In recent years, PR10 protein has become a research focus because of their nuclease similar structures and in vitro antibacterial activity in some species, and scientists have shown that PR10 protein involved in antiviral pathway in plants. But there are still many problems that not clear: Why PR10 proteins of some plants do not have nuclease activity? How do the PR10 proteins recognize pathogen RNA? What signal transduction pathway that PR10 proteins involved in? Tobacco as a model plant of molecular plant pathology research, however, there are not reseach reports on the PR10 protein. The applicants of this study has cloned tobacco PR10 protein gene NtPR10, based on this, some experiments will be done in this project to research expression characteristics，nuclease activity and in vitro antibacterial activity of tobacco PR10 protein, and the Laser Scanning Confocal Microscope will be used to analyze the action sites of PR10 in pathogen intracellular, throughing these experiments the molecular mechanism of tobacco PR10 resistance to disease will be elucidated. This project has important scientific significance that will provide the foundation to solve the above scientific issues and analyze the disease resistance mechanism in depth of pathogenesis-related protein involved in plant.

摘要：近年来，PR10蛋白因其具有核酸酶相似结构及其在部分物种中显示的抑菌活性成为了研究热点，并有研究证实其参与了植物的抗病毒途径。但仍有很多问题不清楚：为什么有的植物PR10蛋白不具有核酸酶活性？PR10蛋白识别病原菌RNA的机制如何？PR10蛋白参与哪些信号传导途径？烟草作为分子植物病理学研究的模式植物，未见关于PR10蛋白的相关报道。本研究将以申请者克隆得到的烟草PR10蛋白编码基因NtPR10为基础，研究烟草PR10蛋白的表达特性、核酸酶活性、体外抑菌活性以及利用共聚焦显微镜研究烟草PR10蛋白在病原菌细胞内的作用位点，分析烟草PR10蛋白的抗病分子机理。本项目的开展将为解决上述科学问题及深入分析病程相关蛋白参与的植物抗病机制奠定基础，具有重要的科学意义。

为揭示植物病程相关蛋白PR10的抗病相关分子机理，本项目以烟草病程相关蛋白PR10为对象，利用电子克隆的方法，首次克隆得到烟草PR10 蛋白编码基因NtPR10，并对基因序列进行了生物信息学分析；同时，利用荧光定量PCR技术分析了抗、感烟草品种在TMV和烟草黑胫病的侵染下，NtPR10基因的表达特性，对PR10在抗、感品种中的表达情况进行对比分析，并通过原核表达获得了NtPR10融合蛋白。基因序列分析结果显示，烟草NtPR10基因开放阅读框全长483 bp，编码160个氨基酸，含有病程相关蛋白家族Bet_v_I保守域，不含跨膜区，无信号肽，定位在胞内，具有与核酸酶活性相关的“P-loop”结构。荧光定量PCR结果表明, 在TMV和黑胫病菌诱导下，NtPR10基因在感病品种G28和小黄金1025中表达量明显增加，G28在诱导后4天表达量达到了高峰期，小黄金1025在第2天、第16天表达量较高；在抗病品种枯斑三生和革新三号中，NtPR10基因的表达趋势相对平缓，表达量增幅明显低于感病材料，部分时间点表达量低于对照。综合试验结果分析表明，NtPR10基因在烟草中属于组成型表达，病原菌诱导下，在感病品种中表达量迅速增加，参与了抗病相关生物过程；但在抗病品种中，由于抗病基因在抵御病原菌的侵染中起主导作用，NtPR10基因表达量明显减弱，其与抗病基因的互作及抗病相关信号途径的关系还需深入研究；同时还发现在不同病原菌的诱导下，NtPR10基因的表达也存在差异，在抗感材料中，NtPR10基因对病毒病害TMV的反应速度和最高表达量均高于真菌病害烟草黑胫病，分析原因可能与不同病害的致病机理有关。.本项目的实施，首次克隆得到了烟草病程相关蛋白PR10编码基因NtPR10，明确了其在病原菌诱导下的表达特性，并分析了NtPR10在抗、感品种中表达差异，获得了烟草PR10原核表达融合蛋白，为研究植物病程相关蛋白PR10抗病相关分子机理奠定了基础。发表学术论文2篇，申请专利1项，培养硕士研究生1名。