调控愈合期肌成纤维细胞转分化改善肌腱愈合质量

Tendon injuries are encountered routinely in orthopedic practice. Fibrosis may occure accompanied with ECM oversynthesis when tendon healing. The function of injury tendon may be fail. The mechanisms for prevent fibrosis are unknown. Our data shown: HGF can decrease the levels of a-SMA, Collagen I, Collagen III and Fn, which induced by TGF-β1 in cultured rat's MCL or Achilles tendon fibroblasts. We also found HGF induced more apoptosis of myofibroblasts and higher mRNA level of Smad3 and MMP2. We hypotheses: HGF may promote apoptosis of myofibroblasts to regulate tenocyte transdifferentiation by MMP signal pathway in SD rat Achilles tendon, it may adjust ECM metabolism for adverse fibrosis. We set different experiments to verify the hypothesis. 1.To validate myofibroblasts apoptosis by HGF through flow cytometry and TUNEL; 2.To test if HGF can adjust ECM by promoting myofibroblasts apoptosis; 3.To find the mechanisms of HGF anti-fibrosis through cell signal trasduction research by blocking different enzymes.

运动导致的肌腱损伤逐年增多，病理性修复常伴有ECM的过度合成，导致的纤维化会严重影响功能，保证愈合的前提下，预防和逆转纤维化尤为重要。我们的数据表明：HGF能对抗TGF-β1 诱导的大鼠韧带或肌腱ECM过度合成，对抗肌成纤维细胞转化，同时增加肌成纤维细胞的凋亡，并伴有Smad3 的mRNA 表达降低和MMP2 的mRNA 表达增加。提出以下假设：HGF 可能通过促进愈合期肌腱细胞凋亡调控肌腱细胞转分化，并通过激活MMP增加ECM代谢，从而可能逆转纤维化。拟从以下方面进行验证：1、进一步通过流式细胞仪、TUNEL 等方法对HGF 引起的肌成纤维细胞凋亡进行验证；2、确定HGF 是否能通过促进细胞凋亡调控肌成纤维细胞转分化，并进而影响ECM 组分的代谢；3、利用不同的酶阻滞剂，通过信号转导研究，从机理上确定HGF 引起肌成纤维细胞凋亡在预防和逆转纤维化中的作用。

肌腱损伤后经常表现为瘢痕愈合，容易再次断裂，甚至导致残疾。我们前期研究发现：TGF-β1是重要的具有促进愈合和促纤维化作用的细胞因子，其能够使SD大鼠肌腱细胞大量转分化为肌成纤维细胞（myofibroblast，MFB），同时伴有I、III 型胶原、FN 等细胞外基质（ECM ）成分过度合成。而当加入肝细胞生长因子（HGF）后，则能够有效对抗TGF-β1的作用。.本研究针对MFB转分化这一关键环节进行研究，通过调控MFB转分化，达到改善肌腱愈合的目的。本课题分别通过SD大鼠肌腱细胞体外细胞实验和体内肌腱愈合模型实验来进行研究。重要结果为：（1）HGF能够抑制TGF-β1诱导的MFB过度增殖、MFB过度转分化以及ECM过度合成作用，从而对抗TGF-β1过度产生导致的纤维化和瘢痕愈合；而调节MFB转分化的机制之一为HGF 增加了MFB的凋亡；（2）进一步研究还发现HGF主要是通过FAK信号通路而非ERK1/2通路抑制MFB增殖、增加MFB凋亡，使细胞外基质中III型胶原和FN产生减少，从而达到对抗TGF-β1 诱导的纤维化作用。（3）动物实验也表明不论应用HGF还是应用胸腺肽β4 (Thymosinβ4)来抑制MFB转分化，都能够使愈合的肌腱结构更优。（4）不论肌腱成纤维细胞还是MFB，都是损伤肌腱修复所必需的，而肌腱中的细胞（成纤维细胞）主要来源于肌腱干细胞，初步研究发现肌腱干细胞在组织工程化肌腱中可作为良好的种子细胞。.本课题研究结果提示可以通过调控MFB转分化，来控制损伤肌腱和韧带愈合的质量。HGF是有效的调控因子之一，进一步研发能够调控MFB转分化的药物有可能应用于临床改善肌腱愈合。其科学意义在于：HGF具有促进细胞增殖、迁移的作用，本研究发现HGF对抗TGF-β1的促进MFB转分化、并进而抗纤维化作用，使HGF有希望成为调控肌腱损伤后优质愈合的潜在药物；对于其信号通路的研究使我们对其作用机制更好的了解；如果结合肌腱干细胞应用，有可能为临床肌腱损伤病人提供一种新的治疗方法。