慢性低灌注诱导小胶质细胞HIF-1α表达上调在自噬调节和脑白质损害中的机制研究

Our previous studies demonstrated that the activation of microglia and the loss of oligodendrocyte played an important role in the chronic low perfusion induced white matter lesions (WMLs). However, the mechanism that microglia induced WMLs is still unknown.Autophagy is a self-protection mechanism, which played a vital role in the regeneration and anti-apoptosis. The chronic low perfusion could increase hypoxia induce factor-1α (HIF-1α), which induced the autophagy of microglia to anti-apoptosis。To further explore the mechanism，the study will detect the relationship between HIF-1α，beclin1，Atg5 and caspase3.　In addition，the study will detect the microglia activationin, oligodendrocyte loss, demyelination-related damage and recognization function in the WMLs mice by silencing HIF-1α expression.The study will provide the theoretic foundation and therapeutical strategy for chronic low perfusion induced microglia mediated WMLs.

我们前期研究表明，小胶质细胞的激活和少突胶质细胞的减少在慢性低灌注脑白质损害(WMLs)中发挥重要作用，但目前尚不清楚小胶质细胞介导WMLs发生的确切分子机制。自噬作为机体自我保护的生理机制，在细胞修复和抗凋亡中发挥重要作用。以缺氧为特征的慢性低灌注微环境早期能上调低氧诱导因子-1α（HIF-1α）的表达，诱导小胶质细胞的自噬而发挥抗凋亡的作用。为了进一步探讨其机制，本研究拟进一步检测HIF-1α与自噬关键调控蛋白beclin1，Atg5和凋亡分子caspase3的之间的调控关系，并证实靶向沉默 HIF-1α的表达对WMLs模型鼠小胶质细胞活性、少突胶质细胞破坏及髓鞘形成、整体认知功能的影响。为慢性低灌注下小胶质细胞介导的WMLs提供理论依据和治疗策略。

在脑缺血缺氧环境下，小胶质细胞的生物学是什么样的效应？HIF-1的在小胶质细胞上的表达情况如何？小胶质细胞是否有自噬发生？其具体发生及调节机制有是怎样的？干扰上述环节是否对脑缺血的神经功能具有保护作用？.研究内容：在体外应用氧糖剥夺模型，检测小胶质细胞的生存率；检测小胶质细胞的炎症细胞因子IL-8和TNF-α表达量；检测小胶质细胞的HIF-1α表达量；④检测小胶质细胞的生存率；⑤检测小胶质细胞的炎症细胞因子IL-8和TNF-α表达量⑥检测小胶质细胞自噬相关蛋白LC3的表达变化;应用激光共聚焦交观察小胶质细胞的GFP-LC3质粒表达变化;应用MDC (单丹磺酰尸胺)及丫啶橙染色，流式细胞仪检测小胶质细胞的自噬变化情况;应用电子显微镜观察小胶质细胞的自噬囊泡形成；⑦阻断HIF-1α的表达，检测对小胶质细胞自噬的影响；⑧检测小胶质细胞的存活率；运用自噬关键调节蛋白beclin1的RNAi作用小胶质细胞，检测小胶质细胞的存活率；⑨建立小鼠局灶永久缺血模型，检测缺血区小胶质细胞的自噬及小鼠神经功能情况；⑩侧脑室注射自噬的抑制剂3-MA，检测抑制自噬后，缺血区小胶质细胞的自噬及小鼠神经功能情况。.j结果：①随着时间延长，小胶质细胞的死亡率逐渐增加，存活率逐渐下降；炎症细胞因子IL-8和TNF-α表达量逐渐增加；阻断HIF-1α的表达，小胶质细胞的死亡率下降，存活率增加；小胶质细胞的炎症细胞因子IL-8和TNF-α表达量减少；⑥体外氧糖剥夺模型中，小胶质细胞自噬增加；⑦体外氧糖剥夺模型中，阻断HIF-1α的表达，小胶质细胞自噬减少；⑧抑制自噬及beclin1蛋白，小胶质细胞的死亡率减少，存活率增加；促进自噬，小胶质细胞的死亡率增加，存活率减少；⑨体内小鼠局灶永久缺血模型中，缺血区小胶质细胞的自噬增加，小鼠神经功能受损；自噬的抑制剂3-MA能减轻缺血区小胶质细胞的自噬及小鼠神经功能缺损情况。.脑缺血缺氧环境诱导小胶质细胞HIF-1α表达上调，并通过beclin1信号通路启动自噬途径，导致了细胞的死亡和炎症反应，并进一步加重了神经功能损伤。干扰自噬途径，可以抑制小胶质细胞的死亡和炎症反应，为缺血性脑卒中提供了理想的脑保护策略。