GPR56调控动脉血栓形成的作用机制研究

Arterial thrombosis such as myocardial infarction is a severe disease. The process of arterial thrombosis formation is complicated, and the collagen receptors on the surface of platelets play important roles in these processes. Our preliminary study demonstrated that type III collagen receptor GPR56 highly expressed in human and mouse platelet surface. Using GPR56 knockout mice, we found that GPR56 deficiency was able to significantly inhibit type III collagen induced platelet aggregation and the platelet spreading on type III collagen. Further study showed that GPR56 deficiency significantly blocked carotid artery thrombus formation. These results indicated that GPR56 plays important roles in platelet activation and arterial thrombus formation. In this application, we will further explore the correlation between myocardial infarction and the expression levels and activity of platelet GPR56, clarify the pattern of GPR56 mediated platelet activation and arterial thrombosis, elucidate the possible signaling pathways mediated by GPR56 in platelet; and investigate the effects of the peptide derived from GPR56 extracellular N terminal on platelet activation and arterial thrombosis. Eventually, the results derived from this project will supply an important theory for development of a new antithrombotic drug targeted on GPR56.

动脉血栓性疾病如心肌梗死等危害严重。动脉血栓形成过程复杂，其中血小板表面多个胶原受体在血栓形成过程中发挥重要功能。我们的前期研究发现，III型胶原受体GPR56高表达于人和小鼠血小板表面；利用GPR56敲除小鼠，证实GPR56缺失能够显著抑制III型胶原引起的血小板聚集，以及血小板在III型胶原上的铺展；进一步研究结果显示，GPR56缺失明显延缓颈动脉血栓形成。这些研究结果首次揭示了黏附GPCR受体GPR56在血小板活化和动脉血栓形成过程中的重要功能。围绕这些前期发现，本课题将结合多种生物学技术和小鼠模型，探究患者血小板GPR56表达水平及功能与心肌梗死的相关性；阐明GPR56介导血小板活化和动脉血栓形成的作用模式，以及GPR56介导的关键分子通路；探讨GPR56胞外氨基末端多肽抗血小板活化和动脉血栓形成的可能性，为研发以GPR56为靶的抗栓药物提供重要理论基础。

粘附G蛋白偶联受体(aGPCRs)是一个独特的GPCRs家族，它调节多种发育和生理过程。GPR56作为一种被广泛研究的aGPCR，已经被证明在细胞与细胞和细胞与细胞外基质(ECM)的相互作用中发挥着重要作用。在本课题中，我们首先验证了GPR56在人和小鼠血小板上的表达，并观察到GPR56在急性心肌梗死患者血小板上的表达有着动态变化过程(第一天GPR56的表达水平明显高于第七天)。在此基础上，我们构建了GPR56基因敲除鼠，并利用多种细胞生物学和分子生物学手段观测了GPR56在体外和体内对血小板功能的影响，进而探讨其调控动脉血栓形成的作用机制。通过体外实验我们发现：1、在孵育胶原的爬片上，gpr56-/-血小板的铺展面积明显低于WT血小板；2、在胶原刺激下，GPR56-/-血小板的聚集程度及血小板活化后ATP释放量明显低于WT小鼠；3、在胶原刺激下，流式细胞仪检测GPR56-/-血小板表面P-selectin表达水平也明显降低；4、富含GPR56-/-血小板血浆，凝血酶诱发的栓块收缩程度明显受到抑制。此外，我们利用人血小板进行了类似研究，结果显示孵育了抗GPR56胞外段抗体的血小板在胶原的刺激下，其聚集、活化程度也受到明显抑制。在动物模型中我们发现：1、GPR56-/-小鼠在激光损伤提睾肌小动脉和氯化铁损伤颈动脉血栓模型中表现出明显的血流中断时间延长，2、在断尾流血实验中，GPR56-/-小鼠的出血时间也显著延长。我们还利用Western-Blot技术揭示了GPR56对血小板活化的影响机制。GPR56可在胶原刺激下激活G13信号通路，促进损伤部位血小板的稳定黏附和血栓栓块的形成。因此，我们的研究证实GPR56在动脉血栓形成的起始阶段发挥着关键作用，通过阻断GPR56响应胶原的初始应答，可显著影响血小板的活化和血栓形成。这一结果可为研发抗血小板药物提供新思路。