对虾血蓝蛋白磷酸化修饰多态性与免疫学意义的研究

It has been demonstrated that infectious disease and genetic characterization degeneration are main factors for limiting shrimp aquaculture sustainable development in our country. Researchers suggested that the understanding of shrimp immunology will be the foundation for shrimp’s disease control. Recently, hemocyanin of shrimp was reported as a multifunctional protein with multiple immunological activities, such as antiviral and antibacterial activities and so on. Our previous evidence indicated that the molecular mechanism of multiple functions is probable related to its molecular diversity in protein and nucleic acid level. Interestingly, we lately found that shrimp hemocyanin can specifically bind to phosphorylated antibodies, and the level of phosphorylation closely related to the different pathogens invasion, suggesting that hemocyanin may be also possess phosphorylation polymorphisms. Therefore, further attempts were made to investigate the polymorphisms of hemocyanin phosphorylation and the immune significance using proteomics, molecular biological and immunological techniques. We believe that the results will indicate the correlation between the shrimp's resistance to different pathogens and types of hemocyanin's phosphorylation. Also, it will be helpful for understanding shrimp immune mechanisms, providing new insights into the control of infectious diseases and the selection of improved variety, and promoting shrimp aquaculture of our country fine and sustainable development.

病害和种质退化被认为是影响目前我国对虾养殖业可持续发展的最关键因素，揭示对虾免疫防御机制是破解这些问题的前提和基础。近年来包括申请者在内的学者们发现对虾血蓝蛋白是一种具有抗病毒、抑菌等多种免疫学活性的多功能蛋白，其功能多样性的分子机制可能与其在核酸、蛋白质水平的分子多态性有关。有趣的是，最近课题组发现对虾血蓝蛋白可以与磷酸化抗体特异性结合，且其磷酸化修饰程度与对虾抵御不同病原微生物的入侵密切相关，这提示，血蓝蛋白可能还具有磷酸化修饰多态性。为此，本项目拟在此基础上，进一步采用蛋白质组学、分子免疫学等技术路线，通过对虾血蓝蛋白磷酸化修饰的多态性与免疫学意义的研究，阐明其磷酸化修饰与对虾抵御不同病原微生物侵袭的相关性，揭示血蓝蛋白功能多样性的磷酸化分子基础。预计其成果将有助于深入了解对虾的免疫防御机制，为寻找新的对虾病害防控、良种选育等策略提供思路，促进我国对虾养殖业的健康、持续发展。

血蓝蛋白是一种存在于对虾血淋巴中的含铜呼吸蛋白。近年来研究发现，血蓝蛋白不仅具有输氧功能，还是一种可以抵御包括病毒、细菌、真菌、异种动物红细胞等在内的多种不同病原体的多功能免疫因子，其免疫功能多样性可能与蛋白及核酸水平多样性有关。本项目前期研究发现，对虾血蓝蛋白可以与磷酸化抗体特异性结合，且其磷酸化修饰程度与对虾抵御不同病原微生物的入侵密切相关，这说明血蓝蛋白可能具有磷酸化修饰多态性。为此，本项目采用蛋白质组学、分子免疫学等技术路线，系统深入地研究对虾血蓝蛋白的磷酸化修饰多态性及其免疫学意义，阐明血蓝蛋白磷酸化修饰的多态性与不同病原微生物感染的相关性，揭示磷酸化修饰对对虾免疫因子或信号通路的调控机制。研究结果表明，血蓝蛋白磷酸化修饰与其凝集活性密切相关，血蓝蛋白去磷酸化后，对副溶血弧菌等6种菌的凝集效价明显提高4-64倍。另外，3种磷酸化抗体检测发现，对虾血蓝蛋白磷酸化修饰程度响应不同病原菌刺激并存在较大差异。进一步，通过LC-MS/MS 对凡纳滨对虾血蓝蛋白大小亚基的磷酸化位点进行了检测，鉴定到10条磷酸化肽，共14个磷酸化位点。采用定点突变的方法构建血蓝蛋白磷酸化位点突变体，表达纯化变体蛋白的免疫活性变化，结果发现，血蓝蛋白HcS-S541A和HcL-S542A突变体对细菌凝集活性增加最为显著。最后，我们发现磷酸化激酶CK2可能参与血蓝蛋白磷酸化修饰的调控，采用RNAi技术对CK2α进行抑制，结果发现血蓝蛋白的丝氨酸磷酸化水平下降率达77%，对不同细菌的凝集活性增加2-16倍。总的来说，本项目首次发现血蓝蛋白小亚基Ser541和大亚基Ser542位点的磷酸化修饰影响其细菌凝集活性，其机制可能与CK2信号通路有关。本项目成果有助于深入阐明血蓝蛋白免疫防御的分子作用机制，为选育抗逆优良对虾品种、建立对虾病害的生态学防治方法等提供科学依据，促进对虾养殖业的健康、持续发展。